UNIVERSIDADE CATÓLICA DE PETRÓPOLIS
CENTRO DE CIÊNCIA DA SAÚDE
CURSO DE BIOMEDICINA
TERAPIA GÊNICA
Uma fronteira para o tratamento da AIDS/HIV-1
Josemar Vinicius Maiworm Abreu Silva
Petrópolis
2012
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Terapia gênica no tratamento da AIDS-HIV1, Trabalhos de Biomedicina
Trabalho que aborda o panorama atual do tratamento da AIDS e a promessa para um tratamento por meio da terapia genética
Tipologia: Trabalhos
2012
1 / 30
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UNIVERSIDADE CATÓLICA DE PETRÓPOLIS
CENTRO DE CIÊNCIA DA SAÚDE
CURSO DE BIOMEDICINA
TERAPIA GÊNICA
Uma fronteira para o tratamento da AIDS/HIV-
Josemar Vinicius Maiworm Abreu Silva
Petrópolis 2012
UNIVERSIDADE CATÓLICA DE PETRÓPOLIS
CENTRO DE CIÊNCIA DA SAÚDE
CURSO DE BIOMEDICINA
TERAPIA GÊNICA
Uma fronteira para o tratamento da AIDS/HIV-
Trabalho apresentado ao curso de biomedicina da Universidade católica de Petrópolis como requisito para aprovação na disciplina de metodologia do estudo e da pesquisa
Josemar Vinicius Maiworm Abreu Silva
Professora orientadora Adriana de Oliveira Afonso, D.Sc
Petrópolis 2012
1. INTRODUÇÃO
O século XX, sem dúvida, marcou-se por um grande progresso científico. O campo biomédico expandia-se exponencialmente. Durante esse período descobriram-se os antibióticos, a começar pela penicilina, a qual diminuiu de forma considerável a taxa de mortalidade por doenças bacterianas; Watson e Crick desbravaram o campo da genética com a descrição da estrutura do DNA; além do transplante de órgãos, que trouxe sobrevida a uma grande população.
O mundo parecia confiante que qualquer doença infecciosa poderia ser combatida por vacinas e antibióticos, porém, quando no primeiro ano da década de 1980 anunciou-se a AIDS, era certo que o progresso da medicina lidaria sem problemas com a ameaça, entretanto passaram-se três décadas e a AIDS é um dos maiores problemas da saúde mundial que até agora já infectou mais de 60 milhões de pessoas, vitimou cerca de 1,8 milhões no final de 2010, sendo, desta forma, considerada um grande desafio para a ciência moderna e futura (3) (2) (1).
Passados alguns anos, encontrou-se presente nos tecidos de pacientes que manifestavam a recente doença, um novo retrovírus, o qual em 1984 foi definitivamente relacionado à AIDS, o HIV ( Human inunodeficience virus) desencadeava os problemas imunológicos notados em pessoas com AIDS (2).
O HIV é vírus do gênero Lentivírus pertencente à família dos Retrovírus, caracterizado pelo grande período de incubação, ou seja, o tempo levado da exposição do indivíduo ao vírus até a manifestação de sintomas primários, que pode levar de meses a 20 anos ou mais. Existem atualmente duas espécies de HIV os quais possuem a mesma característica clínica no organismo infectado: HIV-1, mais pandêmico, causador majoritário de infecções no mundo, possui alta taxa de replicação e altamente agressivo; e o HIV-2, mais endêmico, encontrado principalmente no oeste da África e países europeus de forte imigração africana, produz menos partículas virais, fazendo com que a probabilidade de transmissão seja muito baixa, refletindo o fato dessa espécie ser mais restrita a uma região do globo (4) (1).
2. ESTRUTURA DO HIV-
O HIV-1 ( Figura 1 ) possui forma esférica de grandeza micrométrica e pode ser dividido basicamente em três partes principais, o envelope viral, a matriz viral e o núcleo viral.
REPRESENTAÇÃO DO HIV-
Figura 1: Esquema do HIV-1 - representação esquemática simplificada dos principais constituintes do vírus (as cores são para melhor compreensão) Envelope viral é o revestimento exterior do vírus, composto de uma bicamada lipídica onde estão inseridas aproximadamente 72 cópias de um complexo de proteína HIV conhecido por env. O env é formado pelo percursor gp160 , que é extensivamente glicosilado e proteoliticamente clivado por uma convertase celular – furina, dentro do retículo endoplasmático do hospedeiro, formando as glicoproteínas gp120 e gp41 , as quais ficam ligadas não-covalentemente, de forma que aquela fica anexada na face externa da bicamada a glicoproteína transmembrana gp41 , formando trímeros na superfície do vírus. Esse complexo proteico do HIV é essencial para a fixação da célula hospedeira, desempenhado pelo gp120 , de forma que o gp41 é crítico na fusão celular (5) (6).
3. ETAPAS DE REPLICAÇÃO DO HIV
3.1. ENTRADA NO HOSPEDEIRO
Uma vez o organismo humano infectado pelo vírus HIV, primariamente, o vírus infecta células CD4+T – linfócitos e monócitos/macrófagos, assim como astrócitos e células do sistema nervoso central. Progredida a infecção, há um espalhamento para o tecido linfático que contém células dendríticas foliculares, as quais podem atuar como um local de armazenamento latente do vírus. Ao longo do tempo, a replicação do vírus leva a uma lenta destruição progressiva do sistema imunitário, levando a manifestação dos sinais clínicos da AIDS (Ver página 12 )(6)^. O ciclo de vida do HIV começa quando o vírus infecta um novo hospedeiro. Encontrado o seu hospedeiro, as células CD4+T Linfócito, ocorre à ligação entre a subunidade externa do complexo de proteína do HIV, a glicoproteína gp120 , como o receptor CD4 do linfócito ( Figura 2 e Figura 3 ). Esta ligação conduz a uma alteração estrutural do gp120 que expõe um local, parte N-terminal da gp41 , para a ligação de um co-receptor da família da quimiocina, sendo para o caso do vírus HIV o receptor CCR-5 e CXCR-4, presente em monócitos/macrófagos e células T. A exposição da parte N-terminal da gp41 , também conhecida como peptídeo de fusão, juntamente com os co-receptores, medeiam a fusão entre a membrana viral e a da célula-alvo(6) (7).
ENTRADA NO HOSPEDEIRO
Figura 2: Processo de entrada no hospedeiro: (A) o complexo proteico do vírus gp41 e gp aproxima-se do receptor CD4 (B) Inicialmente o receptor CD4 interage com a gp120 (C) A interação leva a uma mudança conformacional do complexo, de forma que o co-receptor CCR-5 ou CXCR- pode ligar-se a gp41 (D) e, desta forma, ocorre a fusão do vírus com a célula.
Diversas estratégias atuais para inibição da infecção do HIV nas células do sistema imunológico são dirigidas para os mecanismos de interação entre a gp120- CD4 receptor e gp41 -co-receptores (CCR-5 e CXCR-4), restringindo a área gênica, sabe-se que indivíduos com deleção homozigótica do gene que codifica o CCR-5 são saudáveis e protegidos contra a transmissão do HIV-1, sugerindo que a regulação do gene caracterizado não acarreta quaisquer efeitos colaterais clínicos (6).
3.2. TRANSFORMAÇÃO DO RNA VIRAL EM DNA VIRAL Após a fusão do HIV com a célula hospedeira, o núcleo viral – capsídeo – entra no citoplasma e enzimas celulares o dissolvem, dissociando do RNA viral, permitindo que tenha início a transcrição reversa. Inicialmente a enzima transcriptase reversa ( Figura 3 ) utiliza os nucleotídeos presente no citoplasma da célula para sintetizar uma única fita de DNA a partir do RNA viral, utilizando como iniciador um RNAt presente com núcleo viral. À medida que a fita única DNA viral é sintetizada, a RNase-H destrói o RNA viral inicial por hidrólise. Dentro do HIV, a RNase-H existe como um domínio na enzima transcriptase reversa, sendo assim sua ação conjunta a dita enzima. Após degradar o RNA viral, o qual ficava associado ao DNA inicial, a transcriptase reversa completa a fita de DNA, tornando-a uma dupla-fita de DNA. Cabe salientar que uma das formas de inativação da transcriptase reversa é a associação de inibidores no sítio ativo da RNase-H, de forma que esta não consiga degradar o RNA viral, e fique unido não-covalentemente a fita única sintetizada de DNA, não podendo assim, produzir a dupla-fita de DNA onde o complexo RNA/DNA é degradado no citoplasma(8). Antes de chegar ao núcleo, o DNA viral sofre um processamento no citoplasma chamado de processamento 3’ que é reconhecida por enzimas virais pelo terminal de repetição longa (LTR) – sequência de nucleotídeos repetidos nas extremidades do DNA viral – que consiste em uma clivagem endonucleolítica de dois nucleotídeos das extremidades 3’ do DNA viral, a fim de que as terminações 3’ tenham uma citosina e adenina (CA) respectivamente. O fato interessante é que a integração ocorre somente se a sequência correta CA esteja no DNA proviral, essa consequência é muito explorada na inibição da infecção(6) (9)
3.3. INTEGRAÇÃO AO GENOMA DO HOSPEDEIRO A próxima etapa é a translocação da dupla-fita de DNA viral para o núcleo, o qual forma juntamente com a proteína viral vpr , a proteína da matriz p17 e a integrase; o complexo de pré-integração. Sinais de localização nuclear presentes na integrase e na p17 fazem com
alternativo, que gera RNA mensageiros (mRNA) com terminações 3’ e 5’ comuns. Os splicing alternativos são causados pela presença de sinais de processamento ambíguos no genoma viral, podendo formar mRNA sem splicing , único splicing e múltiplos splicing. Cabe ressaltar que somente os mRNA que sofrem múltiplos splicing, que são codificadores das proteínas tat, rev e nef , traduzidas independentemente da interferência de mecanismos virais pela maquinaria celular, devido a importância regulatória de tais proteínas, como foi vista anteriormente para a tat e em seguida para a rev (6)^ (11). Os mRNA que sofreram único ou nenhum splicing tem a presença de íntrons e desta forma, deveriam ficar retidos no núcleo por interação de fatores de splicing até eles serem corretamente processados ou degradados. Para contornar a situação, ocorre a interação entre a proteína viral rev com o terminal 3’ da região íntron do mRNA, chamado de elemento de resposta rev (REE), permitindo a exportação nuclear dos mRNA processados incompletamente (11). Uma vez ligada ao REE do mRNA, a rev estabiliza a formação do complexo juntamente com a exportina-1 e a GTPase Ran, ocorrendo o deslocamento para o complexo dos poros nucleares para exportação. No citoplasma, a Ran-GTP é convertida em Ran-GDP, e assim, dissociando da exportina-1 e do mRNA. O mecanismo de dissociação do rev é desconhecido, mas sabe-se que a proteína viral volta ao núcleo pela interação com a importina- , dissociando no núcleo pela ação da Ran-GTP (11).
3.5. MATURAÇÃO E LIBERAÇÃO DO VÍRUS O mRNA que sofreu splicing alternativo é traduzido nas proteínas, dando origem as proteínas virais gag, gag-pol, vpu, vif e env. A nova partícula do HIV é montada na membrana plasmática da célula hospedeira. Nesse processo, as proteínas virais gag e gag-pol interagem uma com a outra, pelo domínio capsídeo da proteína. O genoma viral é embalado por um processo no qual o sinal de embalamento é reconhecido pelo domínio nucleocapsídeo da proteína gag , que também media a formação do dímero de RNA viral através de um mRNA sem splicing. Além desses fatos, alguns tRNA são embalados e a montagem é parcialmente mediada pelas proteínas vpu e vif (6). A função primária da vpu é auxiliar na liberação da partícula de vírus a partir da superfície da célula assim como da proteína env do retículo endoplasmático, responsável pela síntese de proteínas de membrana(10) (6). Na etapa final do ciclo de vida do HIV, a protease ( Figura 3 ) viral desempenha um papel importante, pois algumas proteínas virais são montadas em uma cadeia longa com
várias proteínas individuais, de forma que tais enzimas só adquirem sua conformação funcional após serem precisamente clivadas e liberadas pela protease. Muitos inibidores são desenvolvidos a fim de impedir a ação da protease (10). Prosseguindo o ciclo, a clivagem proteolítica do gag resulta nas proteínas da matriz, que se deslocam para próximo da região da bicamada interna da membrana, que se condensam para formar uma cônica em torno do genoma viral junto com outras proteínas, e proteínas que se associam as env e embalam o vpr. Por outro lado, a clivagem da gag-pol é feita por frameshift ribossomal durante a tradução, resultando nas proteínas virais integrase, transcriptase reversa e protease, e uma vez que estas são inseridas dentro do capsídeo, e ocorre a maturação do vírus e a sua saída da célula hospedeira, o novo vírus está pronto para uma nova rodada de infecção (6) (10).
Figura 3 : Esquema resumido do ciclo de vida do HIV, e os pontos de possível inibição do ciclo. (A) Entrada do vírus, (B) Transcrição reversa, (C) Ação da protease, (D) Processamento 3’, (E) Integração de transcrição do DNA viral.
CICLO DE VIDA DO HIV E INIBIÇÕES
PROGRESSÃO CLÍNICA DO HIV
Gráfico 1: Progressão clínica do HIV – A linha azul mostra a contagem de células CD4-T por mm³ de sangue e a linha vermelha o número de cópias de HIV por ml de plasma. Note que o período de latência pode variar para mais ou menos anos, pode ficar por toda a vida. Normalmente a fase crônica assintomática do HIV-1 pode abranger de 3 a 20 anos dependendo da taxa de progressão da doença no indivíduo infectado, de forma que a taxa de cópias de RNA viral diminui de alguns milhões de cópias para entre 11.000 – 50.000 cópias por de plasma dando início à fase latente e assintomática (13).
4. ANTIRRETROVIRAIS
Antes de 1990 existiam poucas opções para o tratamento do HIV-1 através de antirretrovirais, a grande parte estava relacionado ao tratamento das doenças oportunistas que poderiam se manifestar. Porém, em meados da década de 1990, com a evolução das pesquisas acerca do ciclo de vida do HIV-1, desenvolveram-se inibidores de importantes enzimas virais: a protease e a transcriptase reversa, além de introdução de regimes terapêuticos combinados com tais inibidores, os primeiros antirretrovirais eficazes (14).
4.1. TERAPIA ANTIRRETROVIRAL POTENTE - HAART O advento da terapia da combinação, conhecida como HAART ( high active antiretroviral therapy ) – Terapia antirretroviral potente, para o tratamento do HIV-1 foi crucial para a redução da mortalidade e morbidade pela AIDS.
A HAART constitui a combinação de várias drogas com diferentes funções no ciclo de vida do HIV-1 atacando os pontos de inibição destacado na seção anterior ( Figura 3 ), e desta forma, suprime drasticamente a replicação e reduz a carga viral no plasma, resultando na reconstituição significativa do sistema imunológico e no aumento da circulação do CD4-T linfócitos (15) (14).
O HIV-1 possui aproximadamente cerca de 10.000 nucleotídeos no seu genoma, de 1 a 10 mutações podem ocorrer em cada replicação. Devido a esse potencial, pode ocasionar uma grande diversidade genética para o HIV-1, fazendo com que as variantes reduzam a sensibilidade de uma ou duas drogas antirretrovirais, consequentemente, o sucesso dos resultados do tratamento HAART, em parte, é devido às múltiplas combinações de fármacos, diminuindo a seleção de variações do HIV-1 no organismo, o que seria mais difícil para um posterior tratamento (14).
Atualmente a terapia HAART evoluiu bastante desde o início da utilização desse tipo de tratamento, além da introdução de novos medicamentos com maior potência e de baixo desenvolvimento de resistência. No Brasil, de acordo com a diretriz do Ministério da Saúde, seguindo a posição dos Estados Unidos da América e Europa, o início do tratamento HAART dar-se quando a contagem de células CD4 no sangue periférico cai para menos de 350/ em um estágio que as partículas virais no plasma podem chegar a mais de 10. cópias (consulte Gráfico 1 ).
Assim, uma nova abordagem para o tratamento da AIDS combinada com a terapia HAART é necessária, e o campo da terapia genética tem se mostrado promissor como alternativa ao uso de drogas antirretrovirais, mas ainda são necessárias novas pesquisas.
PRINCIPAIS ANTIRRETROVIRAIS
Tabela 1: Principais antirretrovirais com a sua ação no ciclo de vida do HIV-1 além do ano de aprovação do uso e circulação.
5. TERAPIA GENÉTICA
Somente ao ser descoberta a estrutura do DNA, no início dos anos 1950 por Watson e Crick, tornou-se claro como a informação hereditária nas células é codificada nas sequências de nucleotídeos de DNA. A vida depende da capacidade de armazenar, obter e traduzir as instruções genéticas necessárias para manter o organismo vivo, desta forma, qualquer interferência nessas informações pode favorecer a longevidade do organismo, ou até sua morte, como no caso do HIV-1.
Partindo da importância do DNA, e desta forma, dos genes, que em 1990 os primeiros testes clínicos de terapia genética foram realizados com a finalidade de combater determinadas doenças, que de alguma forma estivessem ligadas à expressão gênica de células em um indivíduo (19).
Os princípios da terapia genética envolvem a introdução, no paciente, de genes, previamente conhecidos, responsáveis por codificar proteínas que serão benéficas. Assim, células geneticamente modificadas poderão ativar mecanismos de defesa naturais no organismo ou produzir moléculas de interesse terapêutico (19) (20).
Atualmente, muitas pesquisas na área da terapia genética têm como objetivo o tratamento de doenças adquiridas em células somáticas, como a AIDS, neoplasias adquiridas
- câncer, doenças cardiovasculares, do que propriamente doenças hereditárias. A terapia genética é a esperança de tratamento para inúmeras doenças consideráveis incuráveis por métodos convencionais (19) (21).
5.1. VETORES A tecnologia básica envolvida em qualquer aplicação da terapia genética é a transferência gênica por meio de vetores. Vários são os métodos atuais de transferência gênica dentre os quais a microinjeção, eletroporação e método biobalístico são técnicas de inoculação de DNA puro e tem a desvantagem pela transferência ocorrer em ex vivo , e por outro lado, métodos mais elaborados e mais eficientes são mais promissores, destacando-se os vetores virais, que podem ser fragmentos de DNA de vírus contendo o DNA a ser transferido, encapsulados em um vírus previamente inativo não patogênico, com a menor toxidade possível. Para a discussão será levada em consideração o uso de vetores virais (21) (19).
transgene e injetados no paciente ou postos em contado com células específicas do paciente para cultivo celular (21).
Desta forma, os vetores retrovirais tem a habilidade de entrar nas células alvos, descrever seu RNA em DNA pelo auxilio da enzima transcriptase reversa, que é empacotada com o vírus, e se integrar estavelmente no DNA celular, pela conservação dos LTRs no RNA transgene. Uma vez integrado, o gene inserido pode ser expresso nos fatores terapêuticos desejados. O vetor retroviral desprovidos dos genes de replicação – gag, pol e env – é incapaz de reproduzir-se, agindo como agente final de transferência (21).
PRODUÇÃO DO VETOR RETROVIRAL
Figura 4: Produção do vetor retroviral – (A) o gene de interesse é inserido no genoma do retrovírus e transferido para a célula empacotadora (B), a qual criar partículas retrovirais irreprodutíveis com o transgene. (C) Ocorrida a infecção do vetor, (D) a transcriptase reversa, que foi envelopada com o vetor, transforma o RNA em DNA, (E) que integrado e expresso na proteína (fator) de interesse, pode ficar na célula ou ser secretada. A limitação do uso de vetores retrovirais é a incapacidade de infectar células que não estejam em processo de divisão celular, ou seja, quando os alvos do vetor são, por exemplo, células musculares, neurais e até hepáticas. Outro fato é a integração aleatória do transgene no genoma celular, que pode ativar oncogenes ou inativar a expressão de genes supressores de tumor, embora a probabilidade teórica seja bastante pequena, é motivo para ser levado em consideração (19).
A situação de limitação dos retrovírus em relação a infectarem apenas células em divisão pode ser contornada pela a utilização de uma família dos retrovírus, os lentivírus, que é representado pelo próprio HIV-1 como dito inicialmente, o qual já foi desativado e desenvolvido um vetor com sua estrutura. No caso da utilização vetor HIV-1 o gene env na célula de empacotamento deve ser substituído por aquele que seja compatível com o receptor da célula-alvo e seguir os mesmos procedimentos do retrovírus (19).
5.3. VETOR ADENOVIRAL Os adenovírus humanos são vírus de genoma DNA dupla fita, não envelopados, encapsulados em um capsídeo icosaédrico, medido de 70 a 100 de diâmetro. O capsídeo contém em seus vértices espículas por onde se dá a interação com os receptores celulares não seletivos, fazendo que tenha tropismo amplo por células humanas. Na natureza, os adenovírus são capazes de infectar células do trato respiratório e gastrointestinal, causando gripes, gastrites e conjuntivites epidêmicas. Um bom exemplo desse tipo de vírus é o HPV – Vírus do papiloma humano. (21)
Os adenovírus atacam tanto célula em divisão quanto em não divisão, e geralmente seu genoma não é integrado ao da célula hospedeira, ficando na forma de DNA epissomal no núcleo da célula. O genoma adenoviral codifica aproximadamente 15 proteínas, de forma que a porção denominada E1 do DNA viral, a qual está envolvida na replicação do adenovírus, pode ser retirada e substituída pelos genes de interesse, fazendo com que o vírus seja incompetente para a replicação, de maneira análoga na retirada dos genes gag, pol e env do retrovírus (21) (19) (20).
Para a produção dos vetores adenovirais, segue o mesmo princípio para a produção de vetores retrovirais, onde é preciso uma célula empacotadora que tenha os genes que foram retirados, que no caso o E1. A etapa de produção do transgene mais comum é a produção de um plasmídeo com o genoma adenoviral onde o gene E1 é substituído pelo gene exógeno, o plasmídeo com o novo gene pode ser multiplicado em uma cultura de bactéria. Uma vez o plasmídeo purificado, é então colocado nas células empacotadoras formando partículas adenovirais irreprodutíveis ou defectivas ( Figura 5 ) (21).