Existem duas maneiras para seqüenciar o DNA, ou seja, obter a ordem correta de bases nitrogenadas (A, T, C, G) componentes de um fragmento escolhido. Os dois métodos utilizados atualmente são: 1) seqüenciamento manual; 2) seqüenciamento automático. Como o seqüenciamento manual é mais trabalhoso e está em desuso (apesar do princípio ser o mesmo), descreveremos somente o automático. Tendo a seqüência de bases em mãos é possível pesquisar diversos dados como, por exemplo, conhecer a seqüência de um gene, isolar este gene, obter proteínas codificadas por este gene etc. Estes exemplos são os mais triviais. O grande sonho da pesquisa dos genomas é desvendar por completo processos vitais cujos mecanismos existem devido a pequenas ferramentas que são as proteínas. A pesquisa futura das proteínas será realizada em grandes projetos chamados “Proteoma”. (Cientistas afirmam que dentre os 40 a 100 mil genes presentes no ser humano, apenas 3% correspondem a genes estruturais, ou seja, genes que codificam proteínas; os outros 97% são considerados "lixo" da evolução do genoma humano e provavelmente teriam a função de regular a ação dos genes.)

Passos Gerais para Seqüenciar o DNA

O DNA do núcleo de células é extraído por técnicas especiais. O DNA puro é então cortado em vários pedaços utilizando enzimas de restrição. Estas enzimas são muito específicas, isto é, cortam o DNA em locais conhecidos.
Estes pedaços de DNA possuem as pontas conhecidas, pois foram cortados com enzimas conhecidas. As mesmas enzimas são utilizadas para cortar os plasmídios, que são DNA em forma de pequenos círculos. São fáceis de manipular porque, além de pequenos, possuem uma seqüência já determinada previamente. Assim, com o uso de outras enzimas, chamadas ligases, as pontas são unidas: ponta “A” liga-se com ponta “A” e ponta “B” liga-se com ponta “B”.
Este DNA “empacotado” deste jeito é usado como molde em uma reação química para obter diversos fragmentos que serão passados em um gel

para separá-los por tamanho. O aparelho e o gel são tão precisos que separam segmentos que diferem no tamanho por apenas uma base.

Seqüenciamento automático

O uso dos seqüenciadores automáticos é essencial quando se deseja realizar seqüenciamento em larga escala, como nos projetos genoma. O desenvolvimento e utilização de seqüenciadores automáticos tornam mais eficiente e rápido o seqüenciamento de DNA, já que as etapas de leitura do gel e o processamento de seqüências são realizadas através de programas de computador. A reação de seqüenciamento é realizada através do método de Sanger (1979). Na mistura da reação são utilizados nucleotídeos normais e modificados. Estes últimos não possuem a hidroxila 3’, somente apresentam um H (hidrogênio). Isto impossibilita a ligação do nucleotídeo seguinte, pois não há possibilidade de estabelecimento da ligação fosfodiéster. A quantidade dos dois tipos de nucleotídeos colocados na reação é suficiente para que sejam obtidos fragmentos de todos os tamanhos possíveis de um determinado segmento de DNA. Estes fragmentos serão separados um a um no gel de seqüenciamento, montando a seqüência correta. Quatro diferentes substâncias ligadas aos nucleotídeos modificados são empregadas e, uma vez excitadas por um feixe de laser, emitem luz em diferentes comprimentos de onda, ou seja, emitem quatro cores diferentes. Assim, uma vez que em cada uma das diferentes reações (A, T, C, G) foi empregado um fluorocromo diferente, é possível juntar estes produtos e realizar a eletroforese em um único canal do gel de seqüenciamento. Os produtos da reação de seqüenciamento, marcados com os fluorocromos, ao serem submetidos a eletroforese passam pelo feixe de laser, que promove a excitação dos fluorocromos. A luz emitida pelos fluorocromos é detectada por um fotomultiplicador e a informação é processada através de um computador.

Exercício:

O cromatograma da figura 1 foi obtido a partir da análise dos fragmentos de DNA ao lado, quando estes passaram por um sensor capaz de detectar cores diferentes. Em que ordem você espera que eles tenham passado para produzir tal resultado?