Fracionamento Subcelular, Notas de estudo de Biotecnologia

Baixe Fracionamento Subcelular e outras Notas de estudo em PDF para Biotecnologia, somente na Docsity!

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO RIO GRANDE DO SUL

UNIDADE EM BENTO GONÇALVES

BIOLOGIA CELULAR

FRACIONAMENTO SUBCELULAR

MONICHARA MARINELLO

BENTO GONÇALVES, 2010

1. INTRODUÇÃO

O fracionamento celular é utilizado para isolar os diferentes componentes celulares e consiste na homogeneização ou destruição das células por meio de diferentes procedimentos mecânicos ou químicos. Estes procedimentos rompem as membranas plasmáticas e separam as frações subcelulares através, da centrifugação, de acordo com sua massa, superfície e peso específicos. Diversos métodos de centrifugação de homogeneizados são utilizados e a maioria está em solução, geralmente de sacarose, de diferentes concentrações. São utilizadas soluções de açucares devido seu potencial de ajustar-se corretamente e manter a integridade das organelas liberadas da célula. O objetivo principal do fracionamento subcelular é que ocorra a ruptura da Membrana Plasmática e que não ocorra à destruição das organelas celulares. Os principais métodos para que isso ocorra são a sonicação, trituração com homogeneizadores mecânicos ou tratamento com maceradores de alta velocidade. Algumas organelas celulares possuem a característica de permanecerem intactas e outras à de se fragmentarem após estes processos.

3. FRACIONAMENTO SUBCELULAR

O fracionamento subcelular é muito importante para o estudo da química celular, sendo a técnica utilizada para a separação e purificação dos componentes celulares e subcelulares. Os métodos de fracionamento celular realizam a destruição dos limites da célula por diferentes métodos mecânicos ou químicos através da centrifugação de homogeneizados. A separação das frações subcelulares ocorre de acordo com a massa, superfície e densidade da organela celular. Devido a estas características é possível realizar a análise de diversas frações subcelulares por meio de métodos bioquímicos e microquímicos. Em geral são empregadas soluções de sacarose ou outros açucares. Isto porque as concentrações de açucares podem ser corretamente ajustadas para manter a integridade das organelas liberadas da célula. O primeiro passo para a purificação de uma célula é o rompimento da Membrana Plasmática sob condições em que não ocorra a destruição dos componentes internos da célula. Os quatro procedimentos mais utilizados são a Sonicação, uso de Homogeneizador a Alta Pressão, o uso de Maceradores de Alta Velocidade (Moinho de bolas) e o uso de Detergentes. A Sonicação é exposição da célula a vibrações da ordem de 20kHz convertidos em um meio líquido, causando o fenômeno da cavitação. Essas vibrações geram focos de baixa pressão no líquido suficientes para a formação de bolhas muito pequenas. A medida que se prolonga o tempo das vibrações essas bolhas entram em colapso, gerando uma onda de choques que circulam pelo meio líquido e resultam em impacto e aumento da tensão de cisalhamento, o que causa o rompimento celular. O aparelho utilizado chama-se “sonicador” e transmite a energia ultra-sônica por uma sonda Homogeneizadores a Alta Pressão tem como princípio de funcionamento o forçamento da passagem da suspensão celular por um orifício estreito seguida de colisão contra uma superfície rígida e imóvel em uma câmara à pressão atmosférica, ou colisão contra um segundo fluxo sob pressão elevada. A redução instantânea da pressão associada ao impacto provoca o rompimento celular sem danificar biomoléculas. Esse rompimento provoca

aumento da temperatura do meio, e, por causa disso, o equipamento deve ter um eficiente sistema de refrigeração, principalmente nos casos em que a molécula-alvo é termossensível. No tratamento com Maceradores de Alta Velocidade as células são esmagadas entre as paredes de um frasco de vidro e um bastão que gira dentro dele. As condições de rompimento nesse equipamento são facilmente controláveis e a eficiência do processo depende da geometria da câmara de rompimento, da velocidade e do tipo de agitador, do tamanho das esferas, da carga das esferas e da concentração celular, da velocidade de alimentação e da temperatura. Abertura dos orifícios da Membrana Plasmática pode também ser feita através do uso de Detergentes Suaves. Como exemplo de agentes tensoativos há os sais biliares, o lauril sulfato de sódio, o SDS (dodecil sulfato de sódio) e o Triton. A eficiência do rompimento depende do pH e da temperatura e pode ser aumentada por um pré-tratamento à base de solventes orgânicos, como a acetona, que iniciam a estimular a autólise. Ainda há o rompimento celular através de solventes e lize enzimática, que são processos utilizados para hidrolisar paredes de células microbianas. Quando aplicada com cuidado, a homogeneização deixa intacta a maioria das organelas celulares. Esses procedimentos quebram a Membrana Plasmática em pequenos fragmentos, no entanto, o núcleo, os lisossomos, os peroxissomos, as mitocôndrias e cloroplastos permanecem intactos.

FIGURA 1 - Rompimento de células e tecidos. 3.1. ISOLAMENTO SUBCELULAR

centrifugado a alta velocidade para sedimentar as mitocôndrias, os cloroplastos, os lisossomos e os peroxissomos. Após ocorre a recentrifugação do sobrenadante que ocorre com velocidades ainda mais altas. Esta recentrifugação sedimenta os fragmentos da membrana citoplasmática e do retículo endoplasmático. Para a sedimentação dos ribossomos ocorrer é necessário que ocorra uma centrifugação com velocidades ainda maiores que a utilizada para a recentrifugação. Isso gera a porção solúvel do citoplasma no sobrenadante, chamada de Citosol.

FIGURA 3 - Esquema mostrando as diferentes etapas da centrifugação fracionada. Uma amostra de fígado é homogeneizada e em seguida submetida a uma série de

centrifugações de força crescente (lado esquerdo da figura). Do lado direito estão ilustradas as diferentes subfrações que aparecem ao microscópio eletrônico.

As frações obtidas pela centrifugação diferencial correspondem a preparações enriquecidas, mas ainda não puras, de organelas. Repetidas centrifugações em velocidades progressivamente maiores podem fracionar um homogenato celular em seus vários componentes.

FIGURA 4 - Centrifugação Diferencial.

Na centrifugação em gradiente de densidade o grau de purificação obtido é maior. Neste tipo de centrifugação as organelas são separadas por sedimentação através de uma

A centrifugação de equilíbrio é usada para separar componentes subcelulares com base nas suas densidades de flutuação, independente de seu tamanho ou forma. A amostra é misturada com um gradiente contendo alta concentração de sacarose ou de cloreto de Césio. Cada componente subcelular move-se, por centrifugação, até que sua densidade se iguale à do meio, então atingirá sua posição de equilíbrio. Método utilizado para separar macromoléculas marcadas com diferentes isótopos.

FIGURA 7 - Amostras centrifugadas para atingirem a posição de equilíbrio, onde a sua densidade se iguala à densidade da solução de sacarose (a) e a de cloreto de césio (b).

4. ISOLAMENTO DE MEMBRANA PLASMÁTICA

O isolamento de membranas implica em problemas técnicos e delicados, que são resolvidos usando células livres, desprovidas de núcleo e de orgânulos citoplasmáticos, os glóbulos vermelhos dos mamíferos ou hemácias.

4.1. ISOLAMENTO DE MEMBRANAS PLASMÁTICAS DE HEMÁCIAS

Após lavar as hemácias em uma solução salina isotônica, torna-se o meio hipotônico adicionando-se água destilada. As membranas intumescem, arrebentam e perdem seu hialoplasma. Então, por centrifugação obtém-se um depósito de membranas plasmáticas, também chamadas de “fantasmas de hemácias”.

4.2. ISOLAMENTO DE MEMBRANAS PLASMÁTICAS DE AMEBAS

Em amebas é utilizado um meio hipertônico para isolar as membranas plasmáticas. Mas na prática as amebas são colocadas numa solução aquosa de glicerol a 50%, durante uma semana. Sob a ação do meio hipertônico, o hialoplasma se desloca da membrana plasmática e retrai-se ao redor do núcleo arrastando os orgânulos citoplasmáticos. Então as membranas plasmáticas são fragmentadas por trituração e após são centrifugadas, a pequenas velocidades, onde os corpos celulares ficam reunidos e se depositam, deixando os fragmentos de membranas plasmáticas sobrenadante.

5. ISOLAMENTO E EXTRAÇÃO DE DETERMINADOS CONSTITUINTES

HIALOPLASMÁTICOS

A ultracentrifugação diferencial é utilizada para isolar os diferentes orgânulos citoplasmáticos, deixando no sobrenadante a parte solúvel do hialoplasma em estado diluído. Os constituintes insolúveis como filamentos e grânulos sedimentam junto com os orgânulos durante a centrifugação.

6. ISOLAMENTO DE ORGÂNELAS CELULARES

6.1. ISOLAMENTO DE FRAÇÕES E SUBFRAÇÕES DE RIBOSSOMOS

A técnica utilizada para o isolamento de ribossomos livres no hialoplasma (bactérias, lêvedos, glóbulos vermelhos jovens ou reticulócitos) é diferente da utilizada em ribossomos presos às membranas do retículo (ergastoplasma das células exócrinas do pâncreas ou hepatócitos). As células com ribossomos livres são trituradas mecanicamente numa solução de sacarose 0,88M, contendo cloreto de magnésio 0,01M. Em seguida o homogeneizado é submetido a uma centrifugação fracionada para eliminar os núcleos, as mitocôndrias e os resíduos celulares que se depositam conjuntamente. Após o sobrenadante é centrifugado durante uma hora, onde os ribossomos que se encontravam em suspensão se sedimentam, constituindo a fração de ribossomos das células. Em ribossomos presos às membranas do retículo a trituração não consegue realizar a separação. No entanto, as cavidades aplainadas do retículo se fragmentam em pequenas vesículas, também chamadas de microssomos, apresentando os ribossomos em sua face externa. Estes microssomos, contidos no sobrenadante, são obtidos através da centrifugação fracionada do homogeneizado. O método utilizado para separar os ribossomos das membranas consiste em dissolver as membranas sob a ação de detergentes colocados sobre o sobrenadante. Após ocorre a centrifugação da suspensão que causa a sedimentação dos ribossomos num depósito.

7. ISOLAMENTO DE FRAÇÕES DO NÚCLEO

Triturando-se células num meio que contém sacarose e íons cálcio (Ca2+), e realizando centrifugações diferenciais, obtêm-se uma fração de núcleos interfásicos com suas membranas nucleares ainda intactas. Através da ação de tensioativos, os ribossomos presos à face hialoplasmática da membrana podem ser retirados.

8. DISCUSSÃO

O modelo pedagógico aqui preconizado oferece uma interessante oportunidade para verificação de todos os recursos funcionais envolvidos. No entanto, não podemos esquecer que a adoção de novos métodos exige a precisão e a definição das diversas correntes de pensamento. A constante divulgação e apreciação das informações maximizam as possibilidades por conta do investimento em reciclagem técnica. Acima de tudo, é fundamental ressaltar que o entendimento dos métodos estudados representa uma nova abertura para a compreensão da disciplina de Biologia Celular. Percebemos, cada vez mais, que o avanço do estudo do Fracionamento Celular/Subcelular é de vital importância para o estudo e utilização de Bioprocessos e desenvolvimento de Bioprodutos.

10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Albert, Bruce. Fundamentos da Biologia Celular: uma introdução à biologia molecular da célula. Porto Alegre: Artmed, 1999. Berkaloff, André; Bourguet, Jacques; Favard, Pierre; Guinnebault, Maxime. Biologia e Fisiologia celular. Ed. Edgard Blücher LTDA. São Paulo. COOPER, Geoffrey M., 2001. A célula – Uma abordagem molecular. Segunda edição. Ed. Artmed. De ROBERTIS, E. D. P. e De ROBERTIS Jr., E. M.F., 1993. Bases da biologia celular e molecular. Segunda edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. De ROBERTIS, E. M. F.; Hib, Jose. 2001. Bases da biologia celular e molecular. Terceira edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. Holtzman, Erick. Célula e estrutura celular. Terceira edição. Rio de Janeiro: Guanabarra. 1986. JÚNIOR, A. P. e KILIKIAN, B. V., 2005. Purificação de produtos biotecnológicos. Barueri, SP. Ed. Manole.