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Análises Farmacêuticas
MÓDULO 3
Felipe Carvalho, Julia Santos e Rodrigo Sales
Aula 7 : CLAE
Introdução
A cromatografia é uma técnica usada para a separação dos componentes de uma amostra, os quais se distribuem em duas fases, uma estacionária (FE) e outra móvel (FM). A fase estacionária é composta por um sólido ou um líquido sobre um sólido. Permanece imóvel. Já a fase móvel é constituída por um líquido. Move-se através da FE. A configuração do CLAE pode ser planar ou coluna. Normalmente, a CLAE é empregada com dois propósitos:
- Analíticos : separar, identificar ou medir os componentes de uma mistura; geralmente, é feita com uma coluna fina, longa e que fornece uma boa separação com uma boa resolução sob alta pressão.
- Preparativos : purificar uma quantidade significativa de componentes de uma mistura; usa colunas maiores (diâmetro mais elevado) e mais “gordas” que podem ser manipuladas com menos cuidado. Durante a passagem da FM sobre a FE, os componentes da mistura são distribuídos entre as duas fases de tal forma que cada componente é seletivamente re- tido pela FE, resultando em mi- grações diferenciais desses com- ponentes e obtendo a separação cromatográfica dos analitos pre- sentes. Com isso, é possível fazer a identificação (utiliza um pa- drão) e quantificação da amostra (informações relativas à área do pico cromatográfico).
A cromatografia de coluna simples ainda encontra conside- rável uso com propósitos prepa- rativos, principalmente na sín- tese de compostos orgânicos, onde é possível separá-los de acordo com a afinidade com a FM e destiná-los a outros méto- dos analíticos, como espectro- metria de massas, RMN e etc. A alta eficiência surgiu com o uso de colunas metálicas, onde a FM é deslocada por pres- sões elevadas, obtidas com auxí- lio de uma bomba de alta pres- são. Não é uma técnica de análise absoluta, pois necessita de calibração, ou seja, da utilização de pa- drões de substâncias químicas de referência que possam ser comparadas com as amostras com intuito de identificar e também quantificar essas amostras.
Classificação da Cromatografia
A cromatografia tem uma ampla classificação, considerando a técnica, FM, FE e o tipo de croma- tografia. Na cromatografia em coluna, é classificado em líquido-líquido, líquido-sólido, líquido-fase
Mecanismos de separação em CLAE
1) Cromatografia por adsorção
- Forma clássica de cromatografia inicialmente introduzida
- Utiliza uma FE sólida e uma FM líquida.
- O soluto é adsorvido na superfície da partícula sólida da FE devido a interações químicas ou físicas através de processos de sorção-dessorção.
- FE : a sílica-gel e alumina (Al 2 O 3 ) são as únicas usadas. → O grau de retenção depende da polarização de cada molécula ou grupo funcional; → A medida que a polaridade do analito aumenta, maior é o tempo de retenção.
- FM é não polar (hexano, heptano) com adição de solvente moderadamente polar (EtOAc, álcool) 2) Cromatografia por partição (absorção)
- Mais aplicada em CLAE!
- FE : suporte sólido de sílica rígida ou composições baseadas em sílica contendo na sua superfície uma fase líquida na forma de um filme fino com partículas de 1,5 à 10 μm. Essa cromatografia também é defi- nida como FE quimicamente ligada e uma das principais funções é fornecer diferentes polaridades a FE e também recheios estáveis e insolúveis na FM. Quando há forte adsorção ou retenção do soluto na coluna, deve-se aumentar a polaridade da FM para aumentar sua solubilidade na mesma e conseguir deslocar os solutos da FE.
- Regra geral: → Iguala-se a polaridade do soluto com a da FE → Usa-se uma FM com polaridade diferente da FE
- Soluto e FM com polaridades muito semelhantes → gera rápida eluição → detecção ocorre no volume morto da coluna
- Soluto e FE com polaridades muito semelhantes → gera alta retenção. O soluto e a FE devem apresentar polaridades semelhantes, enquanto a FM e a FE devem apresentar polaridades diferenciadas. O processo de interação entre “soluto x FE/FM” é devido ao equilíbrio de partição (solubilidade do soluto) entre as duas fases líquidas. Portanto, a volta de cada componente para a FM depende de sua solubilidade/polaridade ( o retorno do soluto que está interagindo com a FE para a FM é dependente da polaridade do mesmo, ou seja, da solubilidade dele na FM). A: mais polar C: menos polar É importante ob- servar que se a FM não for escolhida de forma correta (pola- ridade adequada), pode ocorrer a não separação dos picos em função do não equilíbrio de parti- ção entre a FE e a FM.
Nesse cromatograma é possível observar que as moléculas com alto peso molecular são as primei- ras a saírem em função de não possuírem nenhuma interação com a coluna (menor tempo de re- tenção) e as moléculas com baixo peso molecular ficarão mais reti- das durante esse tipo de cromato- grafia. 5) Cromatografia de Afinidade
- Interação específica e reversível entre um tipo de molécula do SOLUTO com uma molécula LI- GANTE com especificidade biológica que se encontra ligada a FE.
- Separação mais seletiva de cromatografia → A seletividade sempre ocorre quando material indesejado não interage com a coluna e elui, portanto, primeiro. → Aplicação na purificação de macromoléculas 6) Cromatografia Quiral
- FE possui compostos com carbonos assimétricos para interagir seletivamente com compostos quirais.
- Interação seletiva entre analito e moléculas ligadas à FE que é capaz de diferenciar cada enantiômero através da formação transitória de um complexo diasteroisômero (são estereoisômeros cujas moléculas não são imagens especulares uma da outra).
RESUMO
Os métodos cromatográficos podem ser escolhidos baseados na solubilidade e na massa molar dos componentes
Fase estacionária
Trata-se do suporte não móvel, podendo ser um sólido puro, sólido-líquido ou um gel. É de aço inoxidável 316 tratado e com vários comprimentos e diâmetros. Possui recheio de 1,7 à 10 μm
- As colunas são curtas e com paredes espessas para evitar deformidades com a alta pressão do sistema.
- Colunas de proteção (guarda) : também cha- madas de pré-coluna → Posicionada a frente da coluna analítica → Função: aumentar a vida útil da coluna analí- tica, uma vez que retém as impurezas presentes nas amostras. → Composição é semelhante a composição da coluna analítica. Apresentam os mesmo recheio das colunas cromatográficas.
- Em CLAE, a FE mais utilizada é composta de partículas microporosas de sílica que são permeáveis a FM e mecanicamente estáveis à altas pressões.
- SÍLICA : variedade de tamanho de partículas, formas e tamanhos de poros e pode ser facilmente mo- dificada.
Outros suportes: celulose, polímeros de estireno-divinilbenzeno, alumina, titânia e zircônia (tecnologia para pH extremos)
- Colunas de FASE QUIMICAMENTE LIGADA: FE líquida une-se ao suporte através de reação quí- mica. Exemplo de fases NÃO POLARES ligadas ao suporte: → Grupos alquílicos com cadeias de 2, 4, 8, 18 e 22 átomos de carbonos: C8 e C18;
- Formadas por metilas, sem ramificações: confere natureza apolar. → Grupos fenilas ou alquil fenila. Exemplo de fases POLARES ligadas ao suporte: → Ciano (-CN), amino, ésteres, fenóis e outros. → Grupos sulfônicos, alquil amônio, carboxilas e outros.
tamanho da partícula interna também é possível obter uma maior resolução entre os picos e também um maior número de pratos teóricos que está relacionado com a eficiência de separação.
Cuidados com colunas de sílica
Instrumentação do CLAE
1) Reservatório de fase móvel
- Composto por frascos de vidro que contém a FM. 2) Sistemas de tratamento de solventes Análise prévia como preparação da FM.
- Gases dissolvidos e material particulado → devem ser retirados;
- Desgaseificadores → “ Degasser ” → ultrassom ou borbulhamento gases inertes (hélio); 2 técnicas: “Degasser” e ultrassom para retirar os gases dissolvidos
- Filtração → membrana compatível 0,45 μm (ésteres de celulose, nylon, PTFE e PVDF)
- Preparação diária 3) Sistema de eluição
- Isocrático: constituição do solvente permanece constante;
- Gradiente: composição do solvente é alterada;
5) Sistema de Injeção da Amostra É composto pela alça de amostragem.
- Permite a escolha do volume (5 a 500 μL) → Loop
- Boa precisão A alça de amostragem é associada ao loop que apresenta diferentes volumes nos quais estão rela- cionados com o volume de injeção da amostra. A injeção automática vai proporcionar uma boa precisão, entretanto alguns sistemas também podem ser com injeção manual em que a precisão da injeção depende da mão do analista. 6) Sistema de Amostragem automática O sistema de amostragem é associado ao tipo de sistema de injeção (automático ou manual) e sendo o sistema de amostragem automático, ele terá um carrossel que varia do equipamento/marca para equipamento/marca com o número diferenciado de vials que serão adicionados contendo a amostra com volume de até 1,5 mL. As amostras são previamente filtradas em filtros de 0,45 μm (normalmente filtros de PDVF). Outras membranas de filtração também podem ser utilizadas de acordo com as características da amostra. 7) Sistema da FE e controle de temperatura
- Termostato para coluna: manter a temperatura sob controle durante a análise Há também sistema onde contém a FE em que ele pode ou não ter um controle de temperatura (termostato) que vai proporcionar o controle da temperatura durante toda análise. 8) Sistema de Detecção
- Deve-se obter UM PICO no cromatograma para CADA SUBSTÂNCIA. O sistema de detecção é responsável por gerar o sinal cromatográfico que dará origem ao pico cro- matográfico, correspondente a cada substância Características de um detector ideal:
- Alta sensibilidade;
- Pequeno volume morto;
- Baixo ruído → quanto maior o ruído, menos sensível o limite de detecção (LD);
- Insensibilidade à mudanças na temperatura e vazão da FM;
- Resposta rápida para todos os solutos da amostra;
- Ter uma larga faixa de linearidade (concentrações altas e baixas que serão detectadas pelo sistema);
- Não provocar alargamento do pico;
- Não destruir o soluto; Detectores de fluorescência
- Método de detecção específico para substâncias que fluorescem Detectores por índice de refração
- Acompanham continuamente a diferença no IR da FM pura e o efluente que sai da coluna contendo os componentes da amostra.
- Resposta quase universal e sensibilidade moderada.
- Desvantagens: necessário rígido controle da temperatura (uma vez que o funcionamento do detector por IR acompanha as diferenças no IR da FM pura e o efluente que sai da coluna contendo os compo- nentes da amostra) e sensível a variações na FM. Considerados detectores universais (análogos aos detectores por ionização em chama utilizados na cromatografia gasosa). São confiáveis pois não são afetados pela vazão da FM, entretanto são sensíveis a variações na FM. Detectores fotométricos
- Amplamente mais utilizados na cromatografia líquida
- Baseados na absorbância no UV e no visível.
- Lei de Lambert-Beer
- FM não deve absorver no mesmo 𝜆 da amostra
- Solução sem turbidez.
- DAD: Diode Array Detector
Na imagem, observamos um outro exemplo de uma análise croma- tográfica com CLAE-DAD. O croma- tograma apresenta cinco picos croma- tográficos, no qual cada pico apre- senta um espectro na região ultravio- leta com diferentes picos de absorção máxima. O terceiro e quarto picos apresentam similaridade nos espec- tros o que pode ser indicativo de subs- tâncias semelhantes ou relacionadas. A análise de espectroscopia no ultra- violeta é muito interessante principal- mente porque a maioria dos fármacos absorve na região ultravioleta, o que torna uma análise simples e bastante completa. Detectores por ín- dice de refração = maior sensibilidade (10-^7 ) comparativa- mente aos outros e por isso também é considerado como universal. Detectores eletro- químico, fluores- cência e condutivi- dade elétrica = sele- tivos. Em relação à tem- peratura, o detector por índice de refra- ção é o único que apresenta uma alta variação da res- posta em função da temperatura. Sensível a vazão da FM = resposta varia de acordo com a va- zão da FM
Cromatograma
- É um gráfico que mostra a resposta do detector em função do tempo de eluição. Diferentes espécies SAEM DA COLUNA em tempos de retenção diferentes. Análise Quantitativa
- Os cálculos são baseados na área ou altura do pico obtido no cromatograma
- A concentração do analito é proporcional à área → altura e base do pico Exemplo: Supondo que a massa pesada da amostra (152,66 mg) foi diluída a 100 mL e em seguida diluída de 1/100. Calcule a pureza (%) da matéria prima. Na imagem, é possível ver dois cromatogramas e o cromatograma B (amostra) é referente ao pa- racetamol, sendo essa a primeira configuração qualitativa que podemos observar através desse cromato- grama em função da obtenção do tempo de retenção. Outra variável que podemos observar é a área do pico (calculada por base x altura), sendo possível calcular então a área do pico obtido com o padrão. Se temos a concentração do padrão (o que foi pesado para constituir a solução do padrão), teremos então a possibilidade de calcular a concentração do padrão. Já a área do pico é obtida com a leitura dessa solução preparada e com concentração conhecida do padrão. A área que é obtida para o padrão pode ser compa- rada com a área obtida para amostra e consequentemente conseguimos calcular qual seria a concentração na amostra através da equação em azul.
