Estude fácil! Tem muito documento disponível na Docsity
Ganhe pontos ajudando outros esrudantes ou compre um plano Premium
Prepare-se para as provas
Estude fácil! Tem muito documento disponível na Docsity
Prepare-se para as provas com trabalhos de outros alunos como você, aqui na Docsity
Os melhores documentos à venda: Trabalhos de alunos formados
Prepare-se com as videoaulas e exercícios resolvidos criados a partir da grade da sua Universidade
Responda perguntas de provas passadas e avalie sua preparação.
Ganhe pontos para baixar
Ganhe pontos ajudando outros esrudantes ou compre um plano Premium
Comunidade
Peça ajuda à comunidade e tire suas dúvidas relacionadas ao estudo
Descubra as melhores universidades em seu país de acordo com os usuários da Docsity
Guias grátis
Baixe gratuitamente nossos guias de estudo, métodos para diminuir a ansiedade, dicas de TCC preparadas pelos professores da Docsity
Apostila - Apostila
Tipologia: Notas de estudo
1 / 54
Esta página não é visível na pré-visualização
Não perca as partes importantes!
Aula número 1:
Aula número 2:
Aula número 3:
Aula número 4:
Aula número 5:
Aula número 6:
Aula número 7:
Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata Prof. Assoc. Mario Hiroyuki Hirata
Os avanços nos estudos da biologia molecular em eucariotos tem contribuido significantemente para o entendimento da etiologia das doenças humanas. As técnicas de recombinação dos ácidos nucleicos têm permitido aos pesquisadores identificar os vários genes responsáveis por doenças hereditárias, avaliar os mecanismos de infecção dos microrganismos, conhecer os processos que regulam a diferenciação e proliferação celular (principalmente nos processos neoplásicos), entre outros. A biologia molecular vem também apresentando aplicação bastante expressiva na pesquisa de marcadores genéticos úteis no diagnóstico laboratorial. Por outro lado, as diferenças nas sequências do DNA, observadas entre as espécies ou entre os indivíduos, são extremamente úteis para as análises forenses, os testes de paternidade, a identificação de antígenos de histo-compatibilidade, a identificação de allelos mutantes, a identificação de gêneros e espécies de bactérias, fungos, leveduras, vírus e outros.
especificidade do pareamento entre as bases; a sequência de uma das cadeias polinucleotídicas do DNA é complementar a outra ( cadeia complementar ). A estrutura secundária de dupla hélice (duplex) do DNA, descrita por Watson & Crick em 1953, está disposta linearmente. Entretanto, pode ser também circular como nas bactérias, plasmídeos e certos vírus, e pode ser também de fita simples como em alguns tipos de fagos. Entretanto, a disposição da molécula de DNA nos organismos superiores é de particular importância, onde a informação genética está amplamente concentrada nos cromossomas dentro do núcleo. O comprimento total dos 46 cromossomas humanos tem menos que 0,5 mm, entretanto se extendido pode atingir muitos metros. Isto se deve a que o DNA é compactado na forma super-enrolada em vários níveis: primário, duplex; secundário, ao redor das proteinas ligadas ao DNA (histonas) formando os nucleossomos; terciário, enrolado com os nucleossomas formando um cilindro ou estrutura solenoide; e finalmente quaternária, formando voltas ou “loops”. Esta disposição super-enrolada é a forma natural do DNA.
Os ácidos nucleicos podem ser dissociados e associados por processos físicos e químicos. Em condições fisiológicas, a estrutura de dupla hélice do DNA é bastante estável. No entanto, se essa estrutura for submetida a alta temperatura (90°C a 100°C) ou a pH extremos (menor que 3,0 ou maior que 10,0), ela se separa em duas fitas simples, sofrendo o processo de dissociação, desnaturação ou “melting”. Da mesma forma, ao submeter-se essas fitas simples a condições de associação (temperatura ≤ a 65°C, ou pH próximo de 7,0) por algumas horas, elas podem se reconstituir formando a dupla fita novamente, obedecendo a lei da complementariedade; ou seja a dupla fita somente se reassocia se as bases forem exatamente complementares. Esse fenômeno de associação é também denominado de renaturação, hibridização ou “annealing”. Esses processos de desnaturação e renaturação são essenciais para manipulação dos ácidos nucleicos in vitro , principalmente do DNA, contribuindo enormemente para o isolamento, comparação e identificação desses compostos. Outra propriedade física muito importante dos ácidos nucleicos é a sua capacidade de absorver energia na região do ultravioleta, apresentando o pico de absorbância máxima em 260 nm. Esta propriedade é útil tanto para a quantificação quanto para avaliar a pureza dessas substâncias.
Toda vez que uma célula se divide, todo o seu conteúdo de DNA é duplicado na íntegra, transmitindo em absoluto as informações genéticas contidas na célula precursora, esse processo denomina-se replicação. A replicação ocorrre de forma semi-conservativa , com as duas cadeias precursoras (DNA de dupla fita, dsDNA ) servindo de molde para a síntese da nova cadeia (Figura 2). Dessa forma, para a replicação ocorrer é necessário que dupla fita precursora se abra formando 2 cadeias independentes (fita simples, ssDNA ). Esse é um processo energeticamente desfavorável e ocorre com a ação conjunta de uma proteina DNA-específica e várias enzimas; sendo as fitas simples precursoras replicadas, então, de forma independente e separada. A replicação pode ter início em vários sítios, mas cada origem de replicação é utilizada uma vez, durante um simples ciclo celular. A fita filha é sintetizada pela ação catalizadora da DNA polimerase III , enzima que utiliza como molde a cadeia precursora e incorpora os nucleotídeos de forma sequencial na nova cadeia, produzindo-a de acordo com a lei de pareamento das bases. Como essa polimerase sintetiza DNA na direção de 5' para 3', a síntese de uma das cadeias complementares é realizada de forma contínua enquanto que a outra é sintetizada discontinuamente. Os fragmentos da cadeia discontínua são ligados pela enzima DNA ligase. Muitas outras proteínas estão envolvidas na estabilização e manutenção da integridade das cadeias simples que são precursoras para a síntese da dupla fita, assim como no reconhecimento dos sítios de iniciação. As DNA polimerases possuem também, além da função de sintetizar polinucleotídeos, atividade exonucleásica ou " a correção de leitura " na qual os nucleotídeos incorretamente incorporados são removidos. Essa propriedade é fundamental para a manutenção a integridade da sequência original.
Figura 2. Representação da molécula de DNA durante a replicação: as duas cadeias precursoras são separadas e as cadeias complementares que são sintetizadas.
A síntese protéica não é resultante da leitura direta da sequência nucleotídica do DNA. Sabemos que o DNA está localizado no cromossoma do núcleo da célula e a síntese protéica ocorre quase que na sua totalidade nos ribossomas, localizados no citoplasma. As informações genéticas contidas na sequência nucleotídica do DNA têm que ser transferidas para uma molécula intermediária que pode mover-se para o citoplasma, o RNA mensageiro ( mRNA ), e que ordena, então, a síntese da proteina. O processo de síntese de mRNA é conhecido por transcrição e o tamanho da molécula de mRNA é definido pela sequência de aminoácidos que o ácido nucleico codifica. Apenas uma das fitas do DNA é transcrita dando origem a uma única sequência de mRNA para cada gene. A indicação de qual fita do DNA deve ser transcrita é orientada por uma sequência específica denominada promotor , localizada antes (“upstream”) da sequência a ser transcrita, que é reconhecida pela RNA polimerase (enzima sintetisadora de mRNA). Como a RNA polimerase adiciona sequencialmente monofosfatos de ribonucleosídeo à extremidade 3’ da cadeia de RNA em crescimento, a polimerização ocorre na direção 5’ - 3’. Isto significa que cada molécula de mRNA será identica à sequência nucleotídica da fita de DNA que não é transcrita. O mRNA transcrito é transportado para os ribossomos (RNA ribossômico, rRNA ) no citoplasma, onde ocorre a síntese protéica. O material genético de certos virus (retrovirus) é o RNA e a informação genética segue, portanto, a direção reversa (de RNA para DNA). Este processo é conhecido por transcrição reversa , na qual a sintese de DNA é dirigida pelo RNA e a enzima responsável é denominada transcriptase reversa. Essa enzima tem importante função no ciclo vital dos retrovírus.
A relação entre a sequência de nucleotídeos do DNA e a sequência de aminoácidos da proteina correspondente é denominada código genético. Esse código é universal e é encontrado em todos os organismos vivos. O código genético é lido em grupos de três nucleotídeos, cada um codificando um aminoácido (Tabela 1). Cada sequência de trinucleotídeo é denominada codon e a sequência de condons que codifica um polipeptídeo específico é denominada cistron.
1 a.^ base(5’) 2 a.^ base 3 a.^ base (3’) U C A G U Phe Ser Tir Cis U Phe Ser Tir Cis C Leu Ser Terminação Terminação A Leu Ser Terminação Trip G C Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Glu Arg A Leu Pro Glu Arg G A Isoleu Treo Asp Ser U Isoleu Treo Asp Ser C Isoleu Treo Lis Arg A Met* Treo Lis Arg G G Val Ala AcAsp Gli U Val Ala AcAsp Gli C Val Ala AcGlu Gli A Val Ala AcGlu Gli G
O processo de decodificação pelo qual a informação genética presente na molécula de mRNA dirige a síntese proteica é denominado tradução. Esse processo envolve o mRNA, o rRNA e o RNA de transferência ou tRNA , encontrado no citoplasma. Cada tRNA tem 70-90 nucleotídeos em comprimento e é
“RNA splicing”. Após a remoção dos introns, a RNA polimerase II adiciona uma sequência AAUAAA extremidade 3’ do mRNA, conhecida como poli-A. A maioria dos mRNAs eucarióticos possuem 100 a 200 resíduos de adeninas ligadas à extremidade 3', denominada cauda de poli-A, adicionada pela enzima poli-A polimerase. Antes que ocorra a remoção dos introns, o mRNA sofre a adição de resíduos de 7-metil- guanosina (Caps) na extremidade 5’, denominada metilação Cap. Esse processamento sofrido pelo mRNA torna a molécula mais estável e facilita o seu deslocamento para o citoplasma. Entretanto, mutações que ocorrem nas regiões de junção dos exons podem modificar o mRNA processado, produzindo um mRNA maduro que codifica para uma proteína diferente da original. Alguns genes complexos tem moléculas de mRNA muito grandes, que são processadas de diferentes formas para produzir diferentes mRNA maduros que são traduzidos em polipeptídeos diferentes. Esse processo é denominado processamento alternativo (“alternative splicing”) e ocorre no mesmo tecido mas em diferentes estágios de desenvolvimento e diferenciação e pode também ocorrer em diferentes tecidos.
Existem regiões específicas no DNA, denominadas promotores que identificam o sítio de início da transcrição do RNA (região na qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição). Nos procariotos, os genes que codificam as enzimas pertencentes a uma mesma via metabólica são adjacentes uns aos outros e agrupados ("cluster") ao longo do cromossomos junto com sequências regulatórias. Este conjunto é denominado operon , sendo que a sequência que regula a expressão desses genes é denominada operado r. O operador encontra-se antes (“upstream”) da sequência do promotor, nas posições de -35 a -10 antes do início da sequencia codificante. Nos procariotos, a regulação destes operons obedece a condições nutricionais ou ambientais. O estímulo da expressão de uma enzima em resposta à presença de um substrato particular é denominada i ndução. A lactose, por exemplo, pode servir como fonte de carbono e energia para a Escherichia coli. O metabolismo deste substrato depende da hidrólise de seus componentes, glicose e galactose, pela enzima β-galactosidas e. A presença de lactose ( indutor ) induz a síntese de β-galactosidase por ativação do operon da lactose ( operon lac) , aumentando a taxa de ligação da RNA polimerase ao DNA e a taxa de síntese do mRNA da β-galactosidase. Na ausência do indutor o operon é reprimido pela ação do repressor. O repressor liga-se a uma sequência especifica no operador, bloqueando a ligação da mRNA polimerase ao promotor, inibindo assim a síntese de mRNA que codifica para a β galactosidase.
Os promotores dos eucariotos são elementos que sinalizam o sítio onde a transcrição deve iniciar-se e, possivelmente, controlam o nível de expressão do gene associado. Geralmente estão localizados cerca de 30 bases “upstream” do codon de iniciação (ATG) e ompreendemsêquencias denominadas “boxes” ou “motifs”. As mais frequentes são as TATA, CAT e CG “boxes. Além dos promotores, os genes dos eucariotos possuem sequências regulatórias adicionais conhecidas como amplificadores ("enhancers"), que podem estar muito distantes do promotor (antes ou depois, “upstream” ou “downstream”) e que potenciam a taxa de transcrição. É importante salientar que estes amplificadores não são específicos e potenciam a transcrição de qualquer promotor que estiver na sua vizinhança. A eficiência da expressão de um gene em um tecido específico depende da adequada combinação e integração dos amplificadores, dos promotores e das sequencias adjacentes. O genoma dos eucariotos pode apresentam os pseudogenes que são replicas de genes ativos mas não produzem um produto reconhecível, geralmente ocorrem devido a mutações acumuladas no gene. Transposons são elementos genéticos móveis que se deslocam de uma região para outra do genoma e, enzimaticamente, se integram a estes locais. Desta forma, a localização destes segmentos de DNA no genoma é instável. Estes transposons contém os genes que codificam para as enzimas necessárias à sua inserção e para remobilização para outro sítio. Geralmente, a inserção de um transposon produz mutação ou rearranjo cromossômico variável que abole a função do gene que recebe esse elemento móvel.
Polimorfismo de DNA A análise do DNA humano progrediu na medida em que se conheceu a variabilidade de sequências entre os indivíduos. Mini e microsatélites são sequências curtas, repetidas consecutivamente, que estão distribuidas ao longo dos cromossomas humanos, representando cerca de 40% do DNA. Sua natureza repetitiva faz com que sejam instáveis durante a replicação do DNA de geração para geração. A consequência é que o número de repetições dentro de uma sequência varia largamente entre os indivíduos. Em função dessa variabilidade ( polimorfismo de DNA ), cada indivíduo, exceto gêmeos idênticos, terá um padrão ou perfil de DNA pessoal (“ Fingerprinting ”). Esses perfis são usados para estabelecer a identidade dos indivíduos em diversas situações.
As sequências de microsatélites mais comuns no DNA humano são CA ou GT , dependendo de qual das fitas de DNA está sendo lida, pois há milhares dessas sequências espalhadas no DNA humano. O tamanho da repetição pode ser muito variável e pode fornecer excelentes marcadores genéticos para estudar o comportamento fenotípido das famílias. A maioria dessas sequências repetitivas não produz efeito deletério, entretanto foi demonstrado que uma forma de retardo mental em homens, a síndrome do X frágil, é causada pela expansão de um triplete (CGG) contendo 6 a 54 repetições. Verificou-se também que disturbios neurológicos na distrofia miotônica e na doença de Huntington, estão associados a alterações no tamanho dos microsatétiles. Esta descoberta forneceu a base científica para o fenômeno de antecipação no qual os disturbios genéticos tornam-se mais severos nas gerações subsequentes.
Muitas enzimas que atuam na replicação e transcrição tem sido purificadas e a sua atividade biológica usada in vitro para reações moleculares específicas diretas. A maioria dessas enzimas é isolada de bactérias, fungos, leveduras ou virus. Essas enzimas são utilizadas das mais diversas formas, a saber: clonagem e amplificação de genes de interesse, preparo de sondas de ácidos nucleicos, ensaios de hibridização, entre outras aplicações. As nucleases representam uma categoria de enzimas específicas de ácidos nucleicos que hidrolizam as ligações fosfo-diester dos polímeros de ácidos nucleicos, uma de cada vez. As nucleases podem requerer um grupamento hidroxil terminal livre ( exonucleases ), com especificidade de 3' para 5', ou podem atuar somente em ligações internas ( endonucleases ). As nucleases podem ser específicas para DNA ou RNA. As nucleases DNA-específicas podem catalizar apenas cadeias únicas (por exemplo, a S nuclease) ou cadeias duplas (DNAse I). As endonucleases de restrição são nucleases encontradas naturalmente em bactérias e são denominadas enzimas de restrição porque restringem sua atividade a DNA estranhos. O DNA do hospedeiro não é atacado porque os sítios vulneráveis a suas próprias enzimas são protegidos por um processo denominado metilação do DNA. Cada enzima é designada de acordo com o organismo do qual é derivada. A Eco RI, por exemplo, é uma enzima obtida de Escherichia coli cepa R e foi a primeira enzima desse tipo isolada. A maioria das enzimas de restrição reconhecem sequências de 4, 5 ou 6 nucletídeos. Muito poucas reconhecem sequências maiores. Algumas são denominadas isosquisomeros, por clivar em diferentes sítios dentro de uma mesma sequência (Ex. Xma I e Sma I) e por clivar o mesmo sítio mesmo sendo obtidas de diferentes microorganismos (Ex. Hind III e Hsu I). Outras enzimas reconhecem diferentes sequências com o mesmo sítio interno (Ex. BamH I e Sau 3A). Para cada região da molécula de DNA onde a sequência específica ocorre, a enzima de restrição corta ambas as cadeias de forma reprodutível, formando extremidades assimétricas ou coesivas (“stick-end”) ou simétricas ou cegas (“blunted-end”). Estas enzimas são utilissímas para cortar duplas fitas de grande tamanho em fragmentos reprodutíveis e para preparar DNA de diferentes fontes utilizado em procedimentos de clonagem. As Ligases, como a DNA-ligase usada durante a replicação, catalizam a formação de ligações fosfo- diester entre dois segmentos de ácidos nucleicos. As DNA ligases requerem a presença de um molde complementar, no entanto, as RNA ligases não tem essa exigência para o processamento do mRNA. As Polimerases catalizam a síntese do polímero de ácido nucleico complementar usando uma cadeia precursora como molde. Essas enzimas são fundamentais para a clonagem e ampificação de genes. A Taq DNA polimerase, por exemplo, é uma enzima extremamente útil para a amplificação do DNA in vitro pela reação de polimerização em cadeia ( PCR ). A transcriptase reversa, presente apenas nos retrovírus, cataliza a síntese de DNA a partir de moldes de RNA ou DNA. Essa enzima tem importante função no ciclo vital dos vírus, mas pode ser usada in vitro para procedimentos de clonagem e para o preparo de sondas de DNA a partir de mRNA. A transcrição reversa constitui-se um método útil para produzir uma copia complementar de um gene (denominado cDNA) a partir do mRNA. Dessa forma, o genoma dos retrovirus pode ser identificado em amostras biológicas utilizando esse método..
Tecnologia de DNA recombinante Como vimos, as endonucleases de restrição são enzimas que clivam a molécula de DNA em sítios sequência-específicos. A especificidade de cada enzima proporcionou o desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante. Isto significa que fragmentos de DNA de tamanho reprodutível podem ser produzidos e esses fragmentos contendo um gene particular, por exemplo, podem ser removidos do restante da molécula de DNA e ser inseridos em um DNA carreador, produzindo moléculas de DNA recombinado biologicamente funcionais. Nos primeiros experimentos de recombinação foram utilizados os vetores plasmidiais para carrear fragmentos de DNA estranhos. Plasmideos são pequenos pedaços de DNA circular extra-
Aula número 2
Profa.Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata Marcos de Oliveira Machado
O potencial de aplicações das técnicas de DNA recombinante em laboratórios de Bioquímica Clínica estão se tornando altamente evidentes, especialmente para a análise do diagnóstico das várias doenças genéticas e de outras mais. Correntemente, as análises de DNA para o diagnóstico estão disponíveis somente para algumas desordens genéticas, mas o campo de estudo está rapidamente se expandindo e novas análises estão sendo desenvolvidas. A maioria dos testes de DNA para o diagnóstico envolve a extração de DNA dos leucócitos humanos. Tradicionalmente essas técnicas de extração consomem muito tempo e possuem procedimentos pouco eficientes. A maioria dos métodos populares para esse fim, envolve digestão com proteinase K, que leva aproximadamente dois dias, e requer um grande volume de sangue (10-15 ml), ou utilizam solventes orgânicos como o fenol, clorofórmio e álcool isoamílico, os quais são altamente tóxicos. Embora esses métodos consigam recuperar o DNA de alto peso molecular de uma grande variedade de amostras, eles requerem muitos passos e podem incluir a transferência dos extratos de DNA para recipientes adicionais ou procedimentos de lavagem do material utilizando vários filtros comerciais ou colunas. Estes passos adicionais permitem o aumento das oportunidades de transferência cruzadas de amostras ou a introdução de contaminantes. Tais técnicas não são bem apropriadas para o uso na rotina dos laboratórios clínicos. Portanto, um método simples, rápido e econômico é necessário para a introdução das análises de DNA nos laboratórios de Bioquímica Clínica. Os estudos de ligação genética utilizando a técnica de polimorfismo de tamanho de fragmentos de restrição (RFLP), a reação em cadeia da polimerase (PCR), a técnica de transferência de DNA (“”Southern blot””), e outras, necessitam que o DNA extraído esteja em boas condições de uso; ou esteja livre de contaminantes e interferentes que possam prejudicar a reação. O uso da técnica de precipitação salina para a extração de DNA utilizando como detergente o Triton X-100, evita o uso dos perigosos solventes orgânicos e o alto custo e demorada digestão da proteinase K. Esta técnica envolve a desidratação e precipitação das proteínas celulares com solução de cloreto de sódio concentrada. O DNA extraído fica livre de RNA, de proteínas e da degradação de enzimas. A quantidade e a qualidade do DNA extraído é muito boa comparada com as outras técnicas de extração. O DNA é apropiado para as técnicas de biologia molecular, como as que utilizam o PCR e a digestão com enzimas de restrição.
Os métodos de isolamento e purificação dos ácidos nucleicos consistem de três etapas: (1) lise das
células e solubilização do DNA ou RNA; (2) médodo enzimático ou químico para remover as proteínas
contaminantes e outras macromoléculas; e (3) precipitação alcoólica para isolamento do DNA. Os protocolos
básicos geralmente são aplicáveis a um ampla variedade de materiais.
O método básico compreende a ruptura do tecido com um homogeinizador, a lise celular com o
detergente iônico SDS, extração fenólica das proteinas e precipitação etanólica do DNA. Este método é útil
para preparação de DNA genômico de muitas amostras de tecido ou de linhagens celulares, com um mínimo
de consumo de tempo e trabalho. O DNA genômico produzido é adequado para amplificação por PCR ou
para a disgestão com enzimas de restrição e análise de transferência de DNA. Uma quantidade substancial
de RNA acompanha o DNA genômico, o que dificulta a quantificação por espectroscopia no UV. Algumas
amostras de DNA não amplificam bem por PCR ou não são completamente digeridas com enzimas de
restricão e devem, portanto, ser reextraidas.
Outro método compreende a solubilização dos tecidos ou células com SDS, que inativa as DNAses
endógenas. A proteinase K é usada para digerir as proteinas celulares, seguida de digestão com Rnase para
remover a maioria do RNA celular. O isolamento do DNA segue basicamente o princípio anterior. Este
método é adequado para extrair DNA genômico para análise de DNA por Southern blot ou construção de
bibliotecas genômicas. Porém não é adequado para extrair DNA de tecidos pois não há etapa de ruptura do
tecido conectivo..
O protocolo mais adequado à rotina laboratorial para avaliação de polimorfismos e mutações
genéticas compreende a lise celular com SDS, remoção das proteinas por precipitação com cloreto de sódio
concentrado (“salting-out”) e isolamento do DNA genômico por precipitação etanólica.
A maioria dos procedimentos de purificação e concentração de RNA são semelhantes aos utilizados
na purificação de DNA, exceto que 2,5 volumes de etanol devem ser usados rotineiramente para
precipitação do RNA. É essencial que toda água usada diretamente ou nos tampões seja tratada com
dietilpirocarbonato (DEPC) para inativar as RNases.
O método mais adequado para preparar RNA de boa qualidade envolve a solubilização simultanea
do tecido ou células e inativação de Rnases endógenas na presença de isotiocianato de guanidina, com
subsequente separação do RNA do DNA e das proteínas por ultracentrifugação em gradiente de cloreto de
césio. Dois outros métodos que não requerem ultracentrifugação podem se utilizados: (1) lise com
detergente não-iônico para proporcionar um método rápido para preparação de amostras de RNA
citoplasmático e (2) lise celular com isotiocianato de guanidina, remoção das proteinas pela extração fenólica
em pH ácido, seguida de precipitação do RNA. O segundo método é frequentemente utilizado para
isolamento de genoma dos virus RNA a partir de amostras biológicas
Outros métodos de isolamento e identificação do RNA podem ser : (1) isolamento do mRNA por
cromatografia com oligo-dT celulose; (2) separação eletroforética do RNA em gel de agarose contendo
formaldeido para detecção e quantificação de espécies específicas de RNA por Northern blotting e
hibridização; entre outros.
As bactérias de uma cultura líquida saturada são lisadas e as proteinas removidas por digestão com
proteinase K. Os debris de parede celular, polissacarídeos e as proteinas remanescentes são removidas
pela extração fenólica e o DNA genômico é recuperado do sobrenadante resultante pela precipitaçao com
etanol.
extração, todos os solutos e sais são concentrados com os ácidos nucleicos. Após essa etapa, o ácido
nucleico deve ser extraido com fenol/clorofórmio e precipitado com etanol.
DNA em grandes volumes aquosos : a extração pode ser simplesmente ampliada usando o
mesmo procedimento. (tubos de poliestireno não resistem a mistura fenol/clorofórmio). As etapas de
centrifugação à temperatura ambiente não podem exceder velocidades de 2500 rpm (1200 x g ), pro 5
minutos. O precipitado etanólico deve ser centrifugado em um tubo Corning de parede reforçada por 15
minutos em fotor de angulo fixo a 10.000 rpm (8000 x g ), a 4 o^ C. Tubos de vidro devem ser siliconizados para
facilitar a recuperação de pequenas quantidades de DNA (< 10μg).
Remoção de oligonucleotídeos e trifosfatos: Pequenos oligonucleotídeos (< 30 bp) e
nucleotídeos não incorporados usados na marcação ou outras reações de modificação do DNA podem ser
efetivamente removidos das soluções contendo DNA por duas etapas de precipitação com etanol na
presença de acetato de amonia. Este procedimento não é suficiente para remover completamente grandes
quantidades de ligadores (“linkers”) utilizados nos procedimentos de clonagem. Acetato de amonia não é
recomendável se a amostra de ácido nucleico for fosforilada na extremidade 5’ pela T4 quinase ou na
extremidade 3’ com a transferase terminal, pois os íons de amonio tesiduais inibem essas duas enzimas.
Variações do procedimento de precipitação: O isopropanol pode substituir o etanol, quando se
deseja manter mínimo o volume dos ácidos nucleicos precipitados. O isopropanol é menos volátil que o
etanol e é, portanto, mais difícil de remover por evaporação. Alguns sais são menos solúveis em
isopropanol, e podem ser precipitados com os ácidos nucleicos. É recomendado que a precipitação com
isopropanol seja seguida imediatamente por uma precipitação onvencional com etanol para eliminar
isopopropanol residual e o sal. Alternativamente, cloreto de lítio pode ser usado como o sal de precipitação,
pois o cloreto de lítio é muito mais solúvel no etanol e o precipitado resultante é relativamente isento de sal.
Cloreto de lítio deve ser evitado, entretanto, se o precipitado de RNA for usado como molde para a
transcrição reversa após precipitação.
Grandes mRNA e rRNA podem ser purificados de dsDNS e pequenos RNAs (tRNA e 5S RNA) por
duas etapas de precipitação seletiva com cloreto de lítio na ausencia de alcool, seguida de uma precipitação
convencional com etanol.
Soluções concentradas de ácidos nucleicos : se a concentração de ácidos nucleicos é muito alta
( > 300 μg/mL), um precipitado pode-se formar sem resfriamento durante a precipitação etanólica. Se um
precipitado visível é formado, não é necessário esfriar a amostra ou aguardar algum tempo antes de separar
o precipitado por centrifugação.
Geralmente todos os protocolo em biologia molecular requerem, em alguma etapa, o fracionamento
dos ácidos nculeicos. Técnicas cromatográficas são apropriadas para algumas aplicações e podem ser
usados para separação dos plasmídeos do DNA genômico, bem como separação de DNA genômico dos
debris no lisado celular. A eletroforese, entretanto, tem muito mais resolução que métodos alternativos e é
geralmente o método de fracionamento de escolha. As separações eletroforéticas podem ser analíticas ou
preparativas e podem envolver fragmentos com peso moleuclar variando de menos que 100 Da a mais que
108 Da. Uma variedade de sistemas eletroforéticos foram desenvolvidos para acomodar essa ampla faixa
de variação. Além disso, um fragmento individual pode ser identificado por tecnica de hibridização após a
separaração eletroforética de uma mistura complexa (Southern blot). Este método tem contribuido
grandemente para ao mapeamento e identificação de sequencias de cópia única ou múltipla em genomas
complexos, e facilitado os experimentos iniciais de clonagem de DNA eucarioto.
Os protocolos utilizados para purificação de DNA são geralmente divididos em três categorias: (1)
eluição do DNA de um gel de agarose por diálise, (2) dissolução do gel de agarose e recuperação do DNA
por ligação a partículas de vidro, e (3) eluição pelo aquecimento da agarose de baixo ponto de fusão a 70 o^ C,
e recuperação do DNA pela extração fenólica e precipitação etanólica ou usando uma matrix que liga
especificamente o fragmento de DNA. Atualmente, há vários sistemas de purificação de fragmentos de DNA
no mercado. Esses sistemas diferem no tamanho e o tipo de ácido nucleico que pode ser eficientemente
isolado; nos efeitos dos sais, dos solventes orgânicos e de outras substâncias na eficiência de ligação da
matriz; e no tipo de solvente que é usado para eluir o oligonucletídeo ou o polinucleotídeo da matriz.
Matriz de sílica (vidro) - na presença de iodeto de sódio, DNA e RNA ligam-se seletivamente à matriz
de sílica. Outras substâncias presentes (sais, solventes, nucleotídeos, proteinas, nucleotídeos etc) são
lavados com uma solução de etanol tamponada. O polinucleotídeo ligado é eluido em um reduzido volume
de tampão Tris-EDTA (TE) ou água.
Resina de purificação - é uma resina de purificação com propriedades similares aos sistemas de
matriz de sílica (Magic 1 , Promega). Esta matriz liga polinucleotídeos de dupla fita mais eficientemente que os
de fita simples, e pouco eficientemente os RNAs pequenos (tRNA), DNA de dupla fita de menos que 220 bp
ou oligonucleotídeos.
Adsorção - é um sistema de purificação de ácidos nucleicos, que contém um adsorvente estável
(NENSORB 20, DuPont-NEN) que liga quantitativamente proteinas, RNA e DNA, incluindo oligonucleotídeos
contendo menos que 12 resíduos. A ligação não é afetada por altas concentações de sais, ureia, ou outras
substâncias, mas inibida por alguns solventes orgânicos. O material não ligado é removido com água e o
DNA ou RNA (mas não proteinas) é quantitativamente eluido com um solvente alcoólico.
Gel filtração - os ácidos nucleicos podem ser purificados, separados e fracionados usando colunas
de gel filtração ou colunas de centrifugação (spin columns).
A concentração de DNA ou RNA pode ser estimada por espectrofotometria de absorção no UV ou a
concentração de DNA pode ser realizada por espectroscopia de fluorescencia. Cubetas de quartzo devem
ser utilizadas para a espectrofotometria no UV, enquanto que as de plástico ou vidro podem ser usadas para
a região do visível. Um método alternativo é o método de placa de brometo de etídio agarose..
Literatura recomendada
Davis, L.G. Basic Methods in Molecular Biology. 2a. Ed., L.G. Davis, W. M. Kuehl, J.F. Battey, Eds. 1994, Appleton & Lange, Norwalk, CN, USA, 777 p. Ausubel, F.M. Short Protocols in Molecular Biology, 2nd ed., F.M. Ausubel, Ed.; Green Publising Associates and John Wiley & Sons, 1992, New York, NY.
A força exercida em uma partícula carregada depende do campo elétrico, voltagem ou volts por centímetro, e a carga da partícula, Q. A força sob a partícula carregada é o produto:
A força elétrica, F (^) eletrica , quando exercida na partícula, causará o seu movimento. No entanto, o movimento da partícula no solvente será também influenciado pela resistência, devido a viscosidade, a resistência, a qual exerce uma força é proporcional a velocidade:
A constante de proporcionalidade, f é chamada de coeficiente de fricção (medida de resistência de uma partícula oferece quando em movimento em um solvente).
2. Coeficiente de fricção depende da viscosidade do solvente e do tamanho, e forma da partícula Quanto maior a viscosidade, menor o movimento. Quanto maior ou mais assimétrica a partícula, menor seu movimento através do solvente. O coeficiente de fricção de uma grande partícula tais como proteinas é uma propriedade característica de cada elemento. 3. Mobilidade da partícula Quando um campo elétrico é aplicado em uma partícula carregada, ela inicia a migração. A força eletroforética e a fricçional se opõe uma a outra, e a velocidade dessa aumenta até as forças se igualarem (F (^) eletrico = F (^) resistencia ). A velocidade, v, que uma particula alcança em um campo elétrico, V, é determinado por duas propriedades das partículas - sua carga e seu coeficiente de fricção. Consequentemente, o valor de v/ V é também uma propriedade característica das partículas e é importante o suficiente para receber o seu próprio nome: mobilidade. 4. Efeito do pH do meio Cada íon possui sua carga e mobilidade muito particular. No entanto, quando a solução contém uma substância a qual o pK é próximo do pH do meio, esta substância ocorre em ambas as formas: a carregada e a não carregada. A fração com uma carga será dependente do pK da substância e o pH da solução. Quando o pH é igual ao pK de um ácido fraco, somente 50% das partículas estarão carregadas. Uma unidade de pH abaixo da pKa, 90% das partículas estarão sob a forma carregada. Desde que a carga efetiva de uma substância varia com o pH, a sua mobilidade efetiva também varia com o pH. O pH da solução é escolhido de tal forma, que a partícula a ser separada pela eletroforese, se mantenha em um estado máximo de carga, para sua máxima separação. Os tampões são substâncias iônicas por si, portanto, exercem a função de manterem o pH o mais próximo possível da ideal e fazem parte do processo. 5. Condutividade e movimento dos íons Em qualquer sistema elétrico, a corrente produzida é proporcional a voltagem aplicada;
Na eletroforese, a corrente é um fluxo de íons(em ambas direções). A condutividade é a soma das concentrações multiplicado pela mobilidade efetiva de todos os ions presentes. Um íon com maior mobilidade efetiva carreia uma maior fração da corrente A voltagem, condutividade, e a corrente portanto estão todos relacionados. Se a condutividade está aumentada pelo aumento da concentração salina a corrente se mantém constante, a voltagem deve decrescer. Se decresce a voltagem reduz a força elétrica, F (^) eletrica , nas partículas carregadas, diminuindo o movimento das macromoléculas. O aumento do tempo seria necessário para uma separação, e a resolução diminui devido ao aumento da difusão. Se a condutividade está aumentada numa voltagem fixa, a corrente deve aumentar, portanto aumentando o calor elétrico gerado pelo sistema, desde que o aquecimento é proporcional ao quadrado da corrente. O excesso do aquecimento produz distúrbios convectivo nas soluções, a qual distorce o padrão eletroforético e pode também desnaturar as macromoléculas. Desde que o aumento da condutividade mesmo em voltagem fixa ou corrente tenha efeito deletério, resultados ótimos podem ocorrer quando se conserva a concentração dos ions e portanto a condutividade em valores moderados.
6. Carga e conformação Como já se discutiu, o que determina a migração eletroforética é a carga da partícula que se quer separar. Muitas vezes, a distribuição das cargas não estão desvinculadas a sua conformação estérica, portanto, pode-se alterar a carga de uma partícula dependendo de sua conformação, principalmente em se tratando de macromoléculas. As macromoléculas, em seu estado relaxado, tendem a apresentar alguns eletrólitos ligados fortemente, portanto levando a uma alteração na sua mobilidade. 7. Atmosfera iônica e o potencial zeta Contra-íons, ou íons de carga oposta, naturalmente tendem a circundar próximos a grupos carregados das macromoléculas. No entanto, eles não chegam a neutralizar as cargas das macromolécuals mas, por sua vez estão localizados próximos dos grupos carregados das macromoléculas, formando uma dupla camada de carga em torno dessas, denominadas de atmosfera iônica. As macromoléculas movem-se com a camada de hidratação e com os contra ions. Esses reduzem a carga efetiva das macromoléculas, a um nível dado pelo potencial zeta. Esse potencial significa a energia produzida pela carga efetiva das macromoléculas na superfície de contato, que é a região limite do complexo macromolecular na solução e o material que o está envolvendo. 8. Suportes A grande meta da eletroforese é a separação de uma mistura heterogênea de substâncias iônicas seja ela macromoléculas ou íons simples, em zonas completamente identificáveis. Os suporte devem permitir a penetração do material a ser separado o máximo possível e ainda delimitar o fluxo de volume (eletroforese convencional). A maioria dos suportes oferecem esse princípio determinando o tamanho do poro para o movimento eletroforético das macromoléculas. O tubo capilar também exerce esse efeito. 9. Eletroendosmose O suporte não deve interagir com as moléculas a ser separadas, isso poderia impedir ou inibir a separação. Uma interação comum que pode ocorrer, não é a adsorção usual do material. Mais comumente é o efeito dos grupos carregados que estão ligados ao suporte, que resulta em eletro-endosmose. Como exemplo típico temos o suporte ágar, que é muito utilizado na eletroforese. O ágar é uma mistura de agarose e agaropectina. A agaropectina tem um número relativamente grande de grupos carboxil, que em pH neutro tem contra-íons. Se o campo elétrico for aplicado, os contra-íons irão se mover, mas o grupo carboxil ligados a matrix (agar) não migrarão. Os contra-íons carreia solvente o suficiente para que produza um fluxo significativo nesta direção, esse fenomeno denomina-se de eletro-osmose, que as vezes é denominado de endosmose.
Os tipo de suporte podem variar desde uma solução de sacarose até em substância pouco solúveis como fibras de celulose. Os suportes de meio contínuo mais comuns são: agar, agarose, poliacrilamida e amido. A porosidade ou a média do tamanho do poro em alguns suportes é fixo. Entretanto, em alguns suportes podem ser controlados. Como exemplo, a mudança da concentração do gel de agarose, agar e amido, pode mudar o tamanho do poro. O tamanho dos poros do gel de poliacrilamida mais utilizados para macromoléculas está em torno de 5% a 10%, que separam proteínas de 15.000 a 250.000 Daltons. Esse tipo de suporte separa tanto pelo tamanho do poro como por carga elétrica.
a. Dependendo da matrix Eletroforese livre de Tiselius Eletroforese em acetato de celulose Eletroforese em gel de agar Eletroforese em gel de agarose Eletroforese capilar
b. pH de separação pH ácido pH neutro
A corre nte aplicada: A baixa voltagem, a razão da migração dos fragmentos de DNA linear é proporcional a da voltagem aplicada. Entretanto, a medida que a carga elétrica aumenta, a mobilidade dos fragmentos de DNA de alto peso molecular aumenta diferentemente. Dessa maneira o intervalo efetivo da separação do gel de agarose decresce a medida que a voltagem aumenta. Para obter a máxima resolução dos fragmentos de DNA, o gel deve ser submetido a uma corrente de no máximo 5V/cm
Composição das bases e temperatura: O comportamento eletroforético do DNA em gel de agarose não é significantemente afetado pela composição das bases do DNA ou pela temperatura do gel na corrida. Dessa forma, os geis de agarose e a mobilidade eletroforética dos fragmentos de DNA de diferentes tamanhos não muda entre 4^0 C a 30 0 C. Em geral, os geis de agarose são submetidos a corrida em temperatura ambiente. No entanto, em concentrações muito baixas (0,5%) os géis são pouco consistentes, sendo convenientes trabalhar em baixas temperaturas, pois esses géis ganham mais firmeza, da mesma forma os géis de agarose de baixo ponto de fusão(“low melting” agarose).
1.4. Tampões utilizados Existem uma variedade de tampões que podem ser utilizados para separação eletroforética de DNA.
Tampões concentração formulação Tris-acetato (TAE) 0,04M Tris acetato 0,01M EDTA
50X 242g tris base 57,1 ml ácido acético 100ml EDTA 0,5M(pH8,0) Tris-fosfato (TPE) 0,08M Tris-fosfato 0,002M EDTA
10X 108 g Tris Base 15,5ml de ac. fosfórico 85% 40ml EDTA 0,5M (pH8,0) Tris-borato (TBE) 0,089M Tris borato 0,089M ac. bórico 0,002M EDTA
5X 54g Tris-base 27,5g ác. bórico 20 ml EDTA 0,5M (pH8,0)
1.5. Tipos de Agarose Muitos tipos de agarose estão disponíveis , o que se recomenda para uso diário é o tipo II, baixa eletroendosmose. O inconveniente desta agarose é que possue contaminantes de polissacárides sulfatados que inibem enzimas, como ligases, polimerases, e endonucleases. No entanto, a sua utilização é muito difundida, pois o DNA pode ser purificado e ser utilizado com sucesso nas clonagens e como substratos de reações com essas enzimas
1.6. Coloração do DNA em gel agarose O método mais conveniente para visualizar o DNA no gel de agarose é a coloração por brometo de etidio, que fluoresce sob luz ultra violeta. Esse composto contém um grupo planar, que intercala entre as bases do DNA. A posição fixa do grupo e sua proximidade às bases causa uma ligação do corante com o DNA, que se destaca com um aumento da fluorescência comparada com o corante em solução sob a forma livre. A radiação UV absorvida pelo DNA a 260 nm é transmitida para o corante, ou a irradiação absorvida a 300 nm e 360 nm pelo corante ligado propriamente dito, é emitido a 590nm na região da cor vermelho alaranjada, do espectro visível. O brometo de etídio pode detectar tanto os ácidos nucleicos de simples ou de dupla fita. No entanto, a afinidade do corante pela fita simples é relativamente baixa, e a fluorescência emitida é fraca. Geralmente o brometo de etídio é incorporado no tampão de corrida e no gel a 0,5ug/ml. Nesse caso devemos considerar que a mobilidade linear das fitas duplas está reduzida na presença do corante em aproximadamente 15%. Uma vantagem deste procedimento é a possibilidade de visualizar o gel durante a separação eletroforética, sem a necessidade de remover o gel do suporte e da cuba, simplesmente incidindo a luz UV sob o gel. Mas, se houver necessidade da coloração posterior basta imergir o gel numa solução de brometo de etídio, no próprio tampão de corrida, po r 45 minutos a temperatura ambiente. A descoloração normalmente é dispensada, exceto se houver excesso de corante. Quando a quantidade de DNA é muito reduzida, a pouca fluorescência do brometo de etídio pode interferir na visuallização da banda de DNA. Neste caso recomenda-se imergir o gel em uma solução de sulfato de magnésio a 1mM por uma hora, a temperatura ambiente
1.7. Documentação: O gel de agarose é facilmente documentado, utilizando um sistema de fotografia instantânea ou sistema automatizado de captura de imagem. O filme mais sensível para essa finalidade é fornecida pela
Polaroid, tipo 57 ou 667, asa 3000. Sob a luz UV de no mínimo 2500uW/cm 2 e uma boa máquina , utilizando filtro laranja, expõe-se por alguns segundos. Recomenda-se para a máquina Polaroid modelo DS 34 uma abertura de 5,6 ou 8 e uma velocidade de 4 ou 8 segundos, mas pode variar com a intensidade das bandas e do tamanho do gel. Para padronização tente vários tempos de exposição com várias aberturas.
O gel de poliacrilamida é um suporte bastante utilizado em biologia molecular para separação e caracterização de fragmentos de tamanho menores de DNA, que se tem dificudade por geis de agarose. Descrito por Raymond & Weintrab em 1959. O produto de polimerização da acrilamida, que é o monômero, com a N.N'metilenobisacrilamida, que realiza a reação de "cross linking" ou reação cruzada, gera o suporte de poliacrilamida. A polimerização ocorre por ligação vinílica, sob ação de catalisadores, o perssulfato de amônia, cuja fonte de radicais livres é o N,N,N'N' tetrametilenodiamina(TEMED). Portanto, o oxigênio é um inibidor da reação. O polímero formado são cadeias lineares de poliacrilamida, cuja reação cruzada entre elas é dada pela bisacrilamida. O comprimento médio das cadeias é determinado pela concentração relativa da acrilamida e a quantidade de bisacrilamida. Portanto a relação entre a quantidade de acrilamida e bisacrilamida determina as propriedades físicas do gel, que darão subsídios para separação nesse tipo de gel. O gel de poliacrilamida é utilizado para os fragmentos menores que 1kb. Eles podem ser preparados em uma variada concentração (3,5% a 20%), dependendo do tamanho do fragmento de interesse para a separação e identificação.
Acrilamida (%) Intervalo de separação (nucleotídeos) 3,5 10- 5,0 80- 8,0 60- 12,0 40- 20,0 10-
Os géis de poliacrilamida devem ser preparados entre duas placas de vidro, pois necessita de um ambiente isento de oxigêncio para se polimerizar. O tamanho do gel pode variar de 10cm de altura por 10cm de largura até 20 a 30cm de largura por 40 a 100 cm de altura dependendo da necessidade do sistema; de espessura normalmente para DNA utiliza- se 0,75 a 1,5 mm.
Literatura recomentada
Kaplan, L.A. & Pesce, A.J. Clinical Chemistry: Theory, Analysis, Correlation, 3a. Ed., J.F. Shanahar & J. Roche, eds., 1996, Mosby-Year Book, Inc., St Louis, USA. Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratorial manual. J. Sambrook, E.F. Fritsch & T. Maniats, 3 volumes, 2nd ed., 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY.
Prof. Assoc.Mario Hiroyuki Hirata Profa. Dra. Rosario Dominguez Crespo Hirata
A reação de polimerização em cadeia (“Polimerase chain reaction”, PCR) é a técnica que permite a amplificação do DNA ou RNA in vitro, utilizando-se basicamente de uma reação enzimática catalizada pela polimerase (enzima termoestável) cuja atividade depende de ions Mg++, e ocorre em 3 etapas: “Melting”(ou desnaturação que consiste na separação da dupla fita do DNA a ser amplificado), “annealing”( anelamento ou hibridização- ligação do iniciador ou “primer” ao DNA a ser amplificado) e “extension”(extensão ou seja a polimerização propriamente dita) Metodologicamente a técnica de PCR requer três passos (SAIKI et al., 1.988):
