Métodos de Cultivo de Microrganismos: Técnicas, Meios de Cultura e Efeitos Citopáticos, Resumos de Direito

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DISCIPLINA MICROBIOLOGIA BÁSICA E APLICADA

BMM-

ROTEIRO DE EXERCÍCIOS PRÁTICOS 2022

MEDICINA VETERINÁRIA

Recomendações Retorno Seguro - COVID-

1. Em todas as salas e laboratórios de aulas do ICB teremos: i) dispenser automático de álcool em gel; ii) placas com a informação da obrigatoriedade da vacinação completa (uma dose da vacina Janssen ou duas doses de quaisquer outras vacinas contra o SARS-CoV-2); iii) uso contínuo e adequado de máscaras (cirúrgica ou PFF2); iv) não comer ou beber em sala de aula (Artigo 250 do Regimento Geral da Universidade de São Paulo); v) cartazes fixos nos auditórios, anfiteatros e laboratórios de aulas práticas alertando os alunos.
2. Nas listas de presença serão identificado(a)s com o sinal “@” os estudantes que comprovaram o esquema vacinal completo, estando autorizados a freqüentar as atividades presenciais nos campi da USP. Estudantes não autorizados que compareçam às aulas, devem estar cientes que não lhes será computada a frequência, nem tampouco atribuída à nota.
3. Quando possível, manter distanciamento de 1 metro em postos fixos de trabalho, salas de aula ou laboratórios.
4. As janelas e portas deverão ficar abertas, mesmo com o ar-condicionado ligado.
5. Solicitamos a todos que não se aglomerem em espaços comuns, além da contaminação, para evitar ruído.
6. Consultar Boletins informativos periódicos do retorno seguro.
7. Buscar realizar recreio escalonado (caso possível)
8. A espera dos intervalos devem ser espaços abertos.
9. O afastamento simplificado das atividades de ensino será o mesmo facultado a todos os membros da comunidade, mediante autodeclaração de sintomas compatíveis com Covid-19, que deverá ser inserida nos sistemas corporativos computacionais (no caso dos alunos de graduação no sistema JupiterWeb), segundo o protocolo disponível no site Retorno Seguro. No caso da autodeclaração, o estudante se afasta por 7 dias, persistindo os sintomas mais 3 dias, a partir desse ponto precisa de atestado médico. Durante essa fase, o estudante é afastado da sala de aula e tem as faltas abonadas.
10. A autodeclaração só poderá ser utilizada pelo estudante uma única vez; caso ele se contamine uma segunda vez é necessário atestado médico segundo as normas da USP.
11. Caso algum aluno se contamine, as aulas para aquela turma continuam presencial; pois como todos estarão vacinados e de máscaras, a probabilidade de contaminação em sala de aula é muito baixa.
12. Caso algum professor se contamine, a princípio outro colega assume as aulas, mas se não houver tal competência, as aulas serão repostas no final do semestre.
13. Higienizar as mãos e microscópio antes e depois do uso entre diferentes usuários. Privilegiando uso individualizado.
14. Para maiores informações acesse o portal retorno seguro: https://retornoseguro.usp.br/

II - TRABALHO NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA:

CONCEITOS GERAIS:

O primeiro dever de uma pessoa que trabalha em um laboratório de Microbiologia é adquirir a consciência do “invisível” e recordar que, constantemente, em todas as partes, existem numerosos organismos, a menos que se tenha tomado medidas para eliminá-los. Existem microrganismos inócuos e microrganismos patogênicos. Para que esses microrganismos não contaminem o material de trabalho e não venham a constituir risco para as pessoas saudáveis ou enfermas, foram desenvolvidas diversas técnicas para sua destruição (físicas, químicas ou biológicas), sendo indispensável adotar certas normas a cada vez em que se trabalhe no laboratório. A – AMBIENTE DE TRABALHO: a) Iluminação: o local deve ser bem iluminado, sem projeção de sombras, e essa luz pode ser natural ou artificial. No caso de se adotar uma iluminação artificial, esta não deve modificar a coloração dos meios de cultura, das colônias etc. b) Bancada: deve ser constituída de material liso, impermeável, não combustível e resistente a substâncias ácidas e básicas. c) Assentos: o ideal é que a pessoa trabalhe sentada, devendo o assento ser cômodo e ter a altura suficiente para apoiar os cotovelos sobre a bancada, tornando desta forma o trabalho mais seguro. B – MATERIAIS BÁSICOS: a) Placa de Petri: é uma placa circular de vidro (ou plástico descartável) que é composta de uma base e de uma tampa de superfícies planas. Nesta placa são adicionados os meios de cultura sólidos onde ocorrerá o desenvolvimento dos microrganismos. b) Pipetas Pasteur: são preparadas a partir de um tubo de vidro em diferentes diâmetros (2 até 8 mm). Num dos extremos deve haver algodão hidrófobo, sendo o outro extremo estirado e fechado na chama. Também são comercializadas pipetas Pasteur de material plástico, descartáveis.

c) Alça de platina: possui um cabo onde se acopla um fio de platina ou níquel-cromo. Quando o fio de platina termina no formato de um anel, recebe o nome de “alça”. Se for achatado é chamado de “espátula” e no caso de ser reto, denomina-se “agulha”. Além do material especificado anteriormente, no trabalho bacteriológico se empregam outros materiais de uso corrente em laboratórios. MICROSCOPIA Os avanços na área de Microbiologia estão diretamente relacionados ao desenvolvimento da microscopia. Ainda que existam diferentes tipos de microscópios, o mais utilizado é o de campo claro. Este utiliza a luz branca como fonte de iluminação, cujo feixe passa diretamente através do objeto que se deseja observar. O microscópio é constituído por uma parte mecânica e outra óptica. PARTE MECÂNICA: Base: sustenta o microscópio e permite manter a sua estabilidade. Coluna ou braço: corresponde à parte do microscópio na qual se encontram as lentes oculares e objetivas, além do condensador e do sistema de foco com os parafusos macro e micrométricos. Mesa ou Platina: é uma peça horizontal, com um orifício em sua parte central, que permite a passagem dos raios luminosos, onde se fixa a preparação a observar. Esta peça possui um “carro” que permite deslocar a preparação para melhor observação. Abaixo da platina, encontra-se o condensador. Tubo ou canhão: é um cilindro metálico com interior escuro para evitar a reflexão de luz. O tubo suporta a lente ocular na extremidade superior e, na porção inferior, possui uma peça denominada “revólver”, que é uma peça giratória portadora de objetivas de diferentes ampliações, podendo ser objetivas de 10x, 40x, 100x e, em alguns, 4x.

Ou seja, esta objetiva possui a capacidade de formar imagens independentes que se encontram separadas entre si, na preparação, por uma distância de 0,2 μm. Diafragma: permite regular o feixe luminoso, aumentando ou diminuindo o mesmo. Condensador: corresponde a um sistema de lentes que está colocado abaixo do orifício central da platina e cuja função é condensar os raios luminosos na preparação. Modificações no condensador permitem transformar o microscópio de campo claro em microscópio de campo escuro ou no de contraste de fase. Ocular: é constituída por duas lentes; a superior ou ocular propriamente dita, de tamanho menor, e a inferior, de tamanho maior, chamada de lente de campo. Sempre levam anotado o aumento que produzem (8x, 10x, 12,5x). Objetivas: estas lentes, no geral, correspondem aos aumentos 10 e 40 de microscopia seca, ou seja, existe ar entre a preparação e a lente; e 100 de microscopia de imersão, na qual se utiliza óleo de imersão, entre a preparação e a objetiva. A amplificação total do microscópio é obtida multiplicando-se a amplificação da ocular pela amplificação da objetiva que se está utilizando. Em Microbiologia, a objetiva mais utilizada é a de imersão, cujo aumento é de 100 vezes, de modo que, se a ocular tem um aumento 10x, estaremos amplificando 1000 vezes o diâmetro do observado. Neste tipo de microscopia, coloca-se uma gota de óleo de imersão sobre a lâmina onde está a preparação, de modo que a objetiva fique em contato com esse óleo. O objetivo disso é fazer o feixe de luz, depois que atravessa a preparação, passar através do óleo e não do ar, como ocorre no caso das objetivas secas de 10 e 40, evitando assim a refração dos raios luminosos. CUIDADOS COM O MICROSCÓPIO: A extraordinária precisão, tanto do sistema óptico como do sistema mecânico do microscópio, exige uma série de cuidados que se deve ter após cada observação. A poeira é a maior inimiga do microscópio e ao acumular-se no sistema de foco, faz com que o instrumento perca sua precisão. Nas peças ópticas, a poeira prejudica a qualidade da imagem. O óleo de imersão, as impressões digitais e outras impurezas acumuladas na lente frontal da objetiva prejudicam a nitidez da imagem, que aparece borrada e com pouco contraste. Pelas razões anteriormente descritas, cuidados como: evitar o acúmulo de poeira, óleo de imersão, entre outros, são fundamentais. Para eliminar a poeira e o óleo do sistema óptico, este deve ser limpo utilizando-se um pano seco que não desprenda pêlos ou ainda um pano umedecido em solvente (xilol, álcool, éter, etc.). A parte mecânica deve ser limpa utilizando-se um pano que não desprenda restos. Uma vez terminada a jornada de trabalho e após o procedimento de limpeza do microscópio, este deve ser guardado coberto com plástico apropriado, sendo assim protegido de sujidades.

Módulo I: Bacteriologia

AULA PRÁTICA N° 1

COLORAÇÃO DE GRAM: OBSERVAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM-POSITIVAS E

GRAM-NEGATIVAS. OBSERVAÇÃO MICOSCOPICA DOS MICRORGANISMOS

A observação microscópica tem por objetivo determinar a morfologia e o agrupamento dos microrganismos, as suas características de tintura, além de outras características tais como: movimento, tipo de flagelo, presença de cápsula, esporo etc. O exame microscópico pode ser realizado a partir de uma amostra (exame direto) ou a partir de cultivo. De acordo com a sua preparação, classificam-se em: I – EXAME A FRESCO: microrganismos vivos. a) Sem coloração; b) Com coloração vital. II – ESFREGAÇO FIXADO: microrganismos mortos. a) Com coloração simples; b) Com coloração composta. EXAME MICROSCÓPICO A FRESCO: O exame microscópico a fresco é utilizado, principalmente, para a observação de motilidade em bactérias. No caso de microrganismos de maior tamanho, como fungos e protozoários, esta técnica permite determinar, além disso, as características morfológicas. No exame microscópico a fresco, realiza-se uma preparação úmida entre lâmina e lamínula. Exemplificando, se o material a ser examinado é sólido, como colônias de bactérias, suspender em gotas de soro fisiológico. Entretanto, no caso do material ser úmida como amostra de caldo de cultivo, deposita-se diretamente, com pipeta Pasteur, sobre a lâmina. Deve-se tomar cuidado para que não ocorra formação de bolhas entre a lâmina e a lamínula. Se o exame a fresco for realizado com coloração vital, deve ser agregada à suspensão inicial uma pequena quantidade de algum corante vital como o azul de metileno, pois este permitirá aumentar o contraste dos microrganismos, facilitando assim sua observação. Também existe um tipo de exame a fresco que se realiza em “gota pendente” utilizando uma lâmina escavada. Quando se deseja determinar, através desse tipo de observação, se uma bactéria é móvel, há que se ter em mente que as bactérias, por possuírem cargas negativas em sua superfície externa, estão em constante repulsão. Isto determina um movimento de tipo vibratório, conhecido como movimento browniano. Também podemos observar os movimentos de correntes de líquidos, principalmente, em preparações recentes, nas quais todo o observado se move em um mesmo sentido. As bactérias móveis apresentam, em um mesmo campo microscópico, movimentos em zig-zag, com mudanças de direção ou girando sobre si mesmas, o que permite diferenciá-los dos tipos de movimentos citados anteriormente.

Nas células gram-negativas, o álcool penetra a membrana externa e o complexo violeta-lugol é removido da camada fina de peptideoglicano. Estas células são, em seguida, coradas pelo segundo corante (corante de contraste ou de fundo), a fucsina ou safranina, adquirindo a coloração rosa.

Atividade Prática:

Cada aluno realizará uma coloração de GRAM a partir de esfregaços fixados. Adicionalmente, cada grupo poderá coletar amostras de diferentes ambientes e sítios corpóreos com “swab estéril”, fazendo um esfregaço em lamina de vidro, fixando e corando. Técnica: fazer um esfregaço com as bactérias crescidas em caldo ou placa de ágar, ou com a amostra coletada com “swab estéril”.

• Cobrir o esfregaço com violeta de genciana ou cristal violeta por 1 minuto;
• Lavar;
• Cobrir com lugol (fixador) por 1 minuto;
• Lavar;
• Descorar com álcool-éter e lavar imediatamente;
• Cobrir a lâmina com safranina (ou fucsina) por 10 segundos;
• Lavar novamente em água corrente;
• Secar a lâmina, pressionando-a levemente entre duas folhas de papel de filtro, com o cuidado para não remover o esfregaço corado;
• Observar ao microscópio, com objetiva de imersão (objetiva 100X); Obs.: após a coloração, cuidado para não inverter a face da lâmina com as bactérias;
• O condensador do microscópio deve estar elevado;
• A focalização deve ser realizada com cuidado e paciência, iniciando-se com aumento 10X. Esta coloração é fundamentada no fato de que a mistura álcool-éter dissolve os lipídios da membrana externa das bactérias Gram negativas, que se descoram, corando-se posteriormente com a safranina (ou fucsina). Interpretação: as bactérias gram-positivas retêm o cristal violeta, corando-se de violeta escuro. As bactérias Gram negativas apresentam-se com coloração rosada. Hans Christian Joachim Gram (1853 – 1938)

OBSERVAÇÃO E ANOTAÇÃO DOS RESULTADOS (DESENHAR):

Bactéria (espécie) Descrição microscópica Staphylococcus aureus Streptococcus spp. Escherichia coli Bacillus spp. Amostra coleta com “swab estéril”

AULA PRÁTICA N° 2

CULTURA PURA E ISOLAMENTO BACTERIANO EM MEIOS LÍQUIDOS E

SÓLIDOS

NUTRIÇÃO E CRESCIMENTO DOS MICRORGANISMOS

Os microrganismos, como outra qualquer célula, necessitam de substâncias ou nutrientes para viver e se multiplicar. Quando os requerimentos nutritivos são proporcionados por um organismo vivo, este é denominado HOSPEDEIRO. Se os nutrientes são obtidos por um meio artificial, denomina-se MEIO DE CULTURA. Os requerimentos nutricionais variam de um organismo para o outro e são determinados, em parte, por sua constituição genética e também por fatores ambientais. Os principais elementos da célula são: H 2 , O 2 , (85% na forma de H 2 O), C, N, S e P. Além disso, necessitam de oligoelementos como: Na, K, Ca, Mg, Fé, Zn, Cu, Co, etc. Deve ser considerada também uma série de reações químicas (metabolismo), que permitirão à célula incorporar estes elementos, já que na natureza encontram-se como “compostos”. Estas trocas químicas podem ser de dois tipos:

• Catabolismo: degradação ou decomposição de um substrato com a finalidade de se obter material para a célula e para a obtenção de energia.
• Anabolismo: elaboração ou síntese de compostos. CULTIVO DOS MICRORGANISMOS Para poder estudar os microrganismos é necessário que estes existam em quantidade suficiente, quantidade esta que, geralmente, não é encontrada em seu habitat natural. Para que esse objetivo seja alcançado, utiliza-se o cultivo microbiológico. Cultivar um microrganismo significa proporcionar-lhe, em um meio de cultura, todos os nutrientes dos quais ele necessita para poder multiplicar-se, além de condições ambientais adequadas. Um meio de cultura adequado necessita de:

1. Fonte de energia (que é obtida por fermentação, respiração ou fotossíntese);
2. Fonte de carbono;
3. Fonte de nitrogênio;
4. Fonte de enxofre;
5. Fonte de fósforo;
6. Fonte de minerais (Mg. Fe, K, Mn, Mo, Co, Cu, Zn);
7. Fatores de crescimento: são compostos orgânicos dos quais a célula necessita, mas que não é capaz de sintetizar (aa, vitaminas, purinas, pirimidinas, etc.);
8. Fatores ambientais: a) pH: a grande maioria das bactérias desenvolve-se em pH neutro, todavia, existem microrganismos acidófilos e outros que preferem um pH alcalino; b) Temperatura: segundo a temperatura ótima de desenvolvimento, temos microrganismos:

• psicrófilos: 15 a 20°C;
• mesófilos: 30 a 37°C;
• termófilos: 50 a 60°C.

c) Atmosfera: segundo o requerimento de O2, os microrganismos classificam-se em:

• aeróbios estritos: requerem O 2 atmosférico;
• anaeróbios facultativos: requerem, ou não, O 2 atmosférico;
• anaeróbios obrigatórios: não requerem O 2 atmosférico;
• microaerófilos: requerem concentrações menores de O 2 (<21%);
• capnofílicas: requerem concentrações maiores de CO 2. A microaerofilia pode ser estrita (5% de O 2 ), a qual é obtida com geradores de CO 2 , ou parcial (12 – 17% de O 2 ), obtida em uma jarra de vela. Atmosfera normal: 21% O 2 ; < 0,5% CO 2 ; Atmosfera anaeróbica: 10% H 2 ; 85% N 2 , 5% CO 2 ; Atmosfera microaerófila estrita: 5% O 2 ; 85% N 2 , 10% CO 2 ; Atmosfera micraerófila parcial (vela) (MO capnofílicos): 12 – 17% O 2 ; 5% CO 2. Existem diferentes técnicas para o cultivo de microrganismos anaeróbios obrigatórios, sendo a mais utilizada a jarra anaeróbica que utiliza substâncias químicas que, ao agregar-lhes água, liberam CO2 e hidrogênio, este último, em presença de um catalizador (paládio), une-se ao O2 contido na jarra e forma H2O. Outro sistema é baseado em ácido ascórbico e carvão ativado. d) Pressão osmótica e forças iônicas: existem alguns organismos, como os marinhos, que estão adaptados a crescer em ambientes com altas concentrações de sal (halófitas). e) Tempo de incubação: o tempo de incubação varia segundo a espécie que se deseja isolar. A grande maioria das espécies de interesse clínico humano necessita um período de incubação entre 18 a 48h. Todavia, há exceções como no caso de Leptospiras, Mycobacterium, Mycoplasma, etc. f) Esterilidade: o cultivo dos microrganismos utiliza-se com os seguintes propósitos:
• isolar microrganismos a partir de diferentes produtos (água, leite, alimentos, produtos patológicos);
• multiplicação de uma determinada espécie;
• identificação de um microrganismo através da determinação dos produtos; Para que os objetivos sejam alcançados é imprescindível que todo o material empregado esteja estéril , ou seja, livre de todo tipo de microrganismo. CLASSIFICAÇÃO DOS MEIOS DE CULTURA Os meios de cultura são preparados estéreis que contém todos os nutrientes e elementos necessários para o desenvolvimento microbiano. Classificam-se, segundo seu estado físico, em:
• Líquidos;
• Semi-sólidos;
• Sólidos. Para transformar um meio líquido em semi-sólido ou sólido, utiliza-se uma substância denominada ágar-ágar. Esta é um polissacarídeo ácido obtido de algas marinhas, possui a

TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS DE SEMEADURA E OBTENÇÃO DE

CULTURAS PURAS

A semeadura microbiológica é um procedimento, mediante o qual se deposita (semeia- se), assepticamente, um microrganismo em um meio de cultura. Neste meio de cultura, os microrganismos multiplicar-se-ão produzindo milhões de descendentes que formarão unidades macroscopicamente visíveis, denominadas colônias. O material que contém os microrganismos que serão semeados recebe o nome de inóculo e este procedimento é realizado utilizando-se uma alça de cultivo ou uma pipeta. Para realizar a semeadura, deve-se considerar o estado físico do meio de cultura. As semeaduras podem ser realizadas de:

• meio sólido para meio líquido;
• meio sólido para meio sólido;
• meio líquido para meio líquido;
• meio líquido para meio sólido.  Cultivo puro: é aquele que contém somente um tipo de microrganismo e que se originou a partir de uma única célula.  Semeadura por estria ou disseminação (esgotamento): consiste em passar a alça de cultivo contendo o inóculo sobre a superfície de uma placa de Petri, à qual contém o meio de cultura adequado para a bactéria que se deseja isolar. Ao passar a alça, fazendo estrias separadas umas das outras, objetiva-se que o inóculo seja diluído progressivamente de forma tal que, ao final das estrias, obtenha-se colônias isoladas.  Semeadura por esgotamento:  Semeadura por diluição: a uma mistura de microrganismos faz-se uma diluição seriada e, de cada diluição, realiza-se uma semeadura em placa. Apresenta uma grande desvantagem, que é o isolamento do microrganismo predominante na amostra. Outros métodos de obtenção de culturas puras são:
• Semeadura por difusão em ágar fundido;
• Incubação em temperaturas elevadas (≥ 42°C);
• Adição de substâncias químicas inibitórias (ex. antibióticos);
• Cultivos por enriquecimento.

TIPOS DE CRESCIMENTO BACTERIANO

Os meios de cultura semeados são incubados a uma temperatura e requerimentos de O 2 próprios para cada microrganismo. A forma de evidenciar o desenvolvimento microbiano nos meios líquidos é através da presença de: a) Turbidez uniforme; b) Sedimento; c) Floculação ou grânulos; d) Películas; e) Formação de gás; f) Viragem se solução indicadora de pH. Em meios sólidos o crescimento bacteriano se evidencia pela formação de colônias, que podem apresentar, entre outras, as seguintes características:

1. Tamanho: a) puntiforme (< 0,5 mm); b) de maior tamanho (expresso em mm).
2. Forma: a) Circular; b) Irregular; c) Rizóide; d) Filamentosa.
3. Superfície: a) Plana; b) Meseta; c) Convexa; d) Côncava.
4. Consistência: a) Seca ou opaca; b) Úmida ou brilhante; c) Consistente (consistência similar a manteiga); d) Mucosa (quando tocada com alça forma um filamento); e) Quebradiça (crescimento seco, porém quebradiço, como esperma); f) Membranosa (difícil de suspender em água).
5. Pigmento: Além das características mencionadas anteriormente, as colônias podem ou não apresentar pigmento, o qual pode estar circunscrito na colônia (endopigmento) ou pode estar difundido no meio (exopigmento).
6. Odor: Algumas bactérias apresentam odor característico: amoniacal, fecaloídeo, adocicado etc.

4. As placas de Petri contendo meio sólido e os tubos contendo meio líquido deverão ser abertos próximos (máximo de “um palmo” de distancia) ao bico de Bunsen, para evitar contaminação, principalmente, das bactérias do ambiente. Depois de semeadas, as placas deverão ser incubadas em estufa com tampa voltada para baixo (emborcadas para evitar contaminação e ressecamento do meio). Objetivo da atividade:

1. Realizar o isolamento de bactérias a partir de uma amostra aleatória (ambientes, pioderma, fezes, mão, celular, dinheiro, etc) em um meio de cultura sólido (placa petri contendo ágar nutriente estéril) de modo a obter colônias isoladas em cultura pura;
2. Realizar a coloração de Gram diretamente da amostra para fazer um diagnóstico presuntivo do provável agente bacteriano;
3. Isolar bactérias presentes na microbiota da mão e obter colônias isoladas em meio sólido ágar nutriente.
4. Semear e isolar bactérias cultivadas em meio líquido (caldo). Material: 1 – Swab estéril; 2 – Caldo contendo cultivo bacteriano. 3 – Placa de Petri contendo meio de cultura sólido (ágar nutriente) estéril; 4 – Tubos contendo caldo de cultivo estéril; 4 – Alça bacteriológica; 5 – Lâminas de vidro; 6 – Corantes para Coloração de Gram 7 – Tubo com solução salina estéril 8 - Microscópio Procedimento 1: Cultivo e isolamento de bactérias das amostras a) Depositar a amostra coletada com swab estéril na superfície de uma placa de ágar nutriente; b) Flambar (esterilizar) a alça; c) Semear por esgotamento: a partir de um ponto de inoculação, distribuir o material com a alça bacteriológica previamente esterilizada e esfriada, na placa de ágar estéril, fazendo “estrias ou zig-zag” no restante da placa. Este procedimento “separa/espalha” bactérias e, quando crescem, produzem colônias isoladas.

d) Incubar a placa de ágar nutriente e o tubo com caldo nutriente a 37°C por 24 horas; e) Fixar a amostra em uma lâmina de vidro e realizar a coloração de Gram; f) Desenhar a morfologia microscópica e coloração de Gram das bactérias observadas diretamente nas amostras; Procedimento 2: Cultivo e isolamento de bactérias em meios sólidos e líquidos a) Flambar (esterilizar) a alça; b) Coletar amostra de caldo de cultura contendo bacterias com a alça estéril, e previamente esfriada, e depositar a amostra na superfície de uma placa de ágar nutriente; c) Semear por esgotamento: a partir de um ponto de inoculação, distribuir o material com a alça bacteriológica previamente esterilizada e esfriada, na placa de ágar estéril, fazendo “estrias ou zig-zag” no restante da placa. Este procedimento “separa/espalha” bactérias e, quando crescem, produzem colônias isoladas. d) Flambar (esterilizar) a alça; f) Coletar amostra de caldo de cultura contendo bacterias com a alça estéril, e previamente esfriada, e depositar a amostra no tubo contendo caldo de cultura estéril; g) Incubar a placa de ágar nutriente e o tubo com caldo nutriente a 37°C por 24 horas; Procedimento 3: Cultivo de bactérias da Microbiota Humana Objetivo: constatar a presença e a variedade de microrganismos da nossa microbiota normal das mãos. Verificar o crescimento e diferentes morfológicas microscópicas e macroscópicas das colônias isoladas em placas de Petri contendo ágar nutriente estéril. Material:

• Placa de Petri contendo meio de cultura sólido: 1 placa com ágar nutriente. Procedimento:

1. Umedecer um cotonete (swab estéril) em um tubo contendo solução fisiológica estéril;
2. Coletar amostra das mãos (palmas e região interdigital) com o cotonete e fazer uma marca na superfície da placa contendo meio de cultura sólido (ágar nutriente); Morfologia: Gram: